质粒提取和酶切分析研究报告.pptVIP

Sac1 4-12U/ml Xba1 8-20U/ml DNA限制性内切酶对基因组DNA完全酶切的酶量和所用的时间是负相关的 如Xba1: 50U完全酶切需要5h, 5U完全酶切则需要20h 碱裂解法小量制备质粒DNA 一．实验目的及背景 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒图谱的阅读 复制起始位点Ori? 即控制复制起始的位点。 原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ?抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+? ，Neo 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段? P/E 启动子/增强子 Terms? 终止信号 加poly（A）信号? 可以起到稳定mRNA作用 质粒图谱的阅读 质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 质粒提取和酶切分析 中心实验室 质粒DNA的限制性内切酶酶切分析 1. 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 ，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。 2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。 上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。 1) 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 　 切割后形成 5