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人参皂苷溶血及抗溶血作用研究 人参皂苷溶血及抗溶血作用研究 程大任,付锐,窦德强,康廷国 (辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116620) [摘要]目的:通过对几种单体人参皂苷溶血,抗溶血作用进行研究,得到人参皂苷浓度与溶血度间的关系曲线, 探讨其作用规律.方法:不同浓度的单体人参皂苷溶液和相同浓度的兔血红细胞悬浊液组成的混合溶液充分作用后, 用比色法测定溶血度;不同浓度的单体人参皂苷溶液与相同浓度的对照皂苷溶液混合后加入相同浓度的兔血红细胞悬 浊液,三者组成的混合溶液充分作用后,用比色法测定溶血度并计算保护溶血百分数.通过数理统计软件对数据进行 分析并拟合人参皂苷溶血或保护溶血作用的曲线.结果:在测定的人参皂苷各单体中分别或兼具有溶血和抗溶血的特 性,且溶血和抗溶血能力各不相同.结论:原人参皂苷三醇型人参皂苷Re,Rg,2O(R)一Rg2,20(S)一Rg2和Rh都 具有抗溶血作用,其中20(R)一Rg:,20(S)一Rg:和R}l在较高浓度时还表现出溶血作用;原人参皂苷二醇型人参皂苷 Rb,Rb2,Re和Rd均表现出抗溶血作用,其中Rd还在浓度较高时表现出了溶血作用.齐墩果酸型人参皂苷Ro在较 低浓度便表现出抗溶血作用,未见溶血作用. [关键词]人参皂苷;溶血;抗溶血;溶血度;比色法 人参皂苷具有复杂多样的药理活性,为突出各 个单体皂苷的药理作用,目前对人参皂苷的研究和 应用主要集中在单体皂苷的开发和利用方面.溶血 是皂苷的特性之一,成为单体皂苷作为注射剂使用 时的最大障碍j.皂苷可与血红细胞壁上的胆甾醇 结合生成不溶性分子复合物沉淀,造成血红细胞正 常渗透性被破坏而发生崩解j.人参总皂苷并没有 明显的溶血作用2J,但经分离纯化后的单体皂苷却 分别具有截然相反的溶血和抗溶血作用,而且其溶 血和抗溶血作用的强弱和浓度之间存在着近似的曲 线关系.20世纪70年代日本学者难波恒雄通过 体外溶血实验对7种单体皂苷的溶血活性进行了测 定,奠定了实验基础J.由于测定溶血度方法很 多J,本文首先对溶血实验有影响的几个因素进 行考查,建立最优的溶血实验方法,并用此方法对 10种单体人参皂苷进行溶血,抗溶血作用测定,其 中抗溶血活性测定使用文献[3]的有强溶血作用 的Saponin作为对照皂苷.数据经统计软件处理并 拟合得到皂苷浓度和相应溶血或抗溶血作用的关系 曲线. 1仪器和材料 1.1仪器 SartoriusCP225D型精密天平,80—2离心沉淀 机,Matrix移液器,UNICOUV一2100紫外分光光 度计,uV一3010HITACHI. 1.2动物 家兔,购于沈阳药科大学动物室. 1.3试剂 蒸馏水,医用生理盐水,无菌PBS磷酸缓冲盐 溶液(自制),人参皂苷样品(自制),Saponin (SIGMA公司,$4521). 2方法与结果J 2.1无菌PBS磷酸缓冲盐溶液配制 在950mL浓度为0.8%的NaC1溶液中加入 40.5mL浓度为0.2mol?L的Nail2PO4溶液和 9.5mL浓度为0.2mol?L的Na2HPO4溶液,在 151bf/in(1.034×10Pa)高压下蒸气灭菌20min. 2.21%红细胞悬浊液的配制 家兔耳缘静脉取血,置烧杯中,用缠有少量脱 脂棉的玻璃棒轻轻搅拌,去除血液中的纤维蛋白以 防止凝血,然后将血移入刻度离心管中,加入适量 PBS磷酸缓冲盐溶液,混匀后离心10min(3000r? min),弃去上清液.以此方法重复清洗4～5次, 至上清液呈无色透明,读取充分沉降在底部的红细 胞体积,用PBS磷酸缓冲盐溶液为溶剂按体积比配 制成浓度为1%的红细胞悬浊液,用于实验. [通讯作者]窦德强,E—mail:doudeqiang2003@yahoo.corn.crt. S/NOe酗? 2.3血红素溶液最大吸收波长的测定 取兔血红细胞悬浊液1mL,加入5mL蒸馏水振 摇使充分溶血,离心10min(3000r?min)后取 上清液,uV一3010(700—500nm)作紫外光谱, 溶血作用所释放出的血红素溶液的紫外扫描图谱见 图1,结果显示其在575nm处有最大吸收,为适合 本实验的检测波长. 厂, /\\ /\/\ 7一\-,/,f \～ nt 图1血红素溶液紫外扫描图谱 2.4吡啶含量对溶血实验的影响 分别设定含吡啶浓度为1%,2%,3%,4%, 5%的PBS磷酸缓冲盐溶液,分别取各浓度溶液 4.75mL,加入1%红细胞悬浊液1.25mL,混合均 匀,37c【=水浴保温30min,离心10min(3000r? min)后取上清液,用各组含吡啶的PBS磷酸缓 冲盐溶液作空白,紫外分光光度计575nm处测定吸 光度,结果依次为0.008,0.009,0.010,0.035, 0.255.结果显示吡啶浓度低于3