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PAGE / NUMPAGES 东方百合分子标记技术体系的建立 摘要: 本研究以索蚌（）、康斯坦撒（）及其杂交代为材料构建了东方百合扩增片段长度多态性 ()分析体系.采用改进的 方法, 从东方百合中提取基因组 , 琼脂糖凝胶电泳主带清晰、 纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂, 可被 和 两种限制性内切酶完全酶切。通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程, 成功建立了东方百合 反应体系, 得到了清晰的指纹图谱, 试验结果重复性好. 关键词：东方百合；；提取 ， ， . ( ) . . . . , , . , . ; ; 东方百合学名“ ”?，是由天香百合、鹿子百合、日本百合、红花百合与湖北百合的杂交获得的栽培杂种系。因其花形大、花色艳丽、姿态高雅、香味浓郁备，深受市场欢迎，逐渐取代亚洲百合，成为最重要的百合组。荷兰和美国成为世界百合的培育中心，已培育出数以千计的品种，几乎垄断了国际百合种球市场。我国有着丰富的野生百合资源，全世界百合约有个种，而起源于我国的就有个种和个变种，约占世界百合属植物的一半，其中有个种和个变种为中国特有种。但是缺少拥有自主知识产权的优良百合品种，种球几乎完全依赖进口，而进口的种球种性退化快，严重制约着我国百合产业化的发展。. 随着分子生物学的发展, 出现了多种分子标记技术, 使从基因组水平探讨东方百合遗传变异成为可能. 扩增片段长度多态性( , )是年由荷兰公司和 在和 的基础上发展起来的新一代分子标记技术[].它既克服了 技术复杂, 稳定性差、标记呈显性遗传的缺点,同时又兼有二者之长,具有分辨率高、稳定性好、高效率和高灵敏度等优点,实验结果稳定可靠[]. 产生丰富而稳定的遗传标记,可以用于遗传多样性、基因追踪、基因定位、分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建等各个领域[].目前 技术在植物中的应用非常广泛,除了在小麦、水稻、玉米、大豆、花生等农作物中的应用外,在蔬菜、花卉以及其他观赏树木中的应用也非常广泛[].本研究以形态标记法选育出的东方百合为试验材料, 通过对 反应体系各关键影响因素进行优化, 建立东方百合 反应体系, 从而为构建东方百合的遗传图谱及分子标记辅助育种奠定了基础. 材料与方法 . 试验材料 植物材料 供试材料为材料为索蚌（）、康斯坦撒（）及其杂交代，均为试管培养保存。（种植于南京林业大学花卉实验室温室） 试剂 限制性内切酶 Ⅰ、Ⅰ( )、引物、接头.、酶、连接酶 仪器 分析仪、仪、 型电泳仪、垂直电泳系统 ( )、台式离心机及其它常用仪器。 . 试验方法 . . 的提取 分别采用改良法( 广东野百合 提取和 条件的优化)和国产试剂盒提取试管培养新鲜叶子的，琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，终浓度稀释到μ.两种方法提取的都按步骤进行反应，以比较哪种方法适合技术。 提取步骤(粗提) ()取新鲜百合叶片(去掉基部叶脉密集部分)放入研钵中，加入液氮，反复研磨一 次至叶片成很细的粉末为止; ()将研磨成后的实验材料转入的离心管中，加入℃预热的充分混匀， ℃水浴一分钟，期间振摇次使提取液与实验材料充分反应; ()加入等体积的氯仿异戊醉()，轻缓颠倒离心管混匀，室温下静止， 离心; ()将上清液转入另一离心管中，重复步骤()操作一次; ()将上清转入新的离心管中，加入体积的的，再加入一℃冷却的异丙醉， 轻缓颠倒混匀后冰上静止; ()离心一，弃上清后将沉淀转入的新离心管中; ()加入无水乙醉漂洗次; ()加入 无水乙醉漂洗次: ()沉淀放置于室温或℃恒温箱至酒精味消失，加灭菌溶解，备用。 粗提物的纯化 ()加入 置于℃恒温箱中放置或者过夜; ()取处理后的溶液电泳检测，观察是否去除完全； ()加入碱酚:氯仿:异戊醉()，振摇使其充分混匀，静止，离心; ()取上清于一新的离心管中，重复步骤()操作一次，如果上清比较透明则可以不进行本次操作; ()取上清于一新的离心管中，加入灭菌至总体积为，再加入等体积的氯仿异戊醇()，混匀后室温下静止，离心: ()取上清于一新的离心管中，加入的和一℃预冷的无水乙醇，冰上静止; ()用手指轻轻弹出沉淀中的气泡，离心一; ()弃上清，加入无水乙醇漂洗次; ()加入无水乙醇漂洗次; ()沉淀放置于室温或℃恒温箱至酒精味消失，加灭菌溶解。 . 反应体系的建立 . . 样品酶切连接 酶切与连接采用公司的 （包含 ，连接酶和接头），体系与步骤参照产品