丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶通路介导的p53基因抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的实验研究.docVIP

PAGE PAGE 1 丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶通路介导的p53基因抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的实验研究 　　[摘要]目的探讨人重组p53腺病毒（rAd-p53）注射液抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的分子机制。方法采用rAd-p53注射液转染人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113，观察p53基因过表达对该细胞系增殖及侵袭能力的影响，并用蛋白免疫印迹的方法检测Ad-p53转染前后Tca8113细胞系内丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路相关蛋白，细胞周期及凋亡调控蛋白细胞周期素D1（CyclinD1）、P21、Bcl-2的表达。结果Ad-p53转染后显著抑制Tca8113细胞系增殖和侵袭（P0.01），并促进细胞凋亡（P 　　P21和Bcl-2蛋白可能是AKT信号通路的下游调控基因，AKT信号通路及下游调控基因有望成为肿瘤基因治疗靶点。 　　[关键词]口腔鳞状细胞癌；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路；细胞增殖；侵袭 　　[中图分类号]Q257[文献标志码]A[doi]10.7518/hxkq.2013.02.008 　　口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，常规手术治疗、放疗、化疗会给患者造成生理和心理上的巨大损害[1]。转基因治疗是指将外源性基 　　因导入体细胞以纠正遗传或获得性基因缺陷导致的疾病，目前被认为是最具潜力的治疗肿瘤的新手段。近年来研究表明：抑癌基因p53的突变或失活与多种肿瘤发生发展密切相关，并可能与某些肿瘤转移及患者预后有关[2]。人重组p53腺病毒（recombinantade-novirus-p53，rAd-p53）是针对p53表达异常的新兴肿瘤基因治疗制剂，本研究用腺病毒载体将p53基因导入鳞状细胞癌Tca8113细胞，观察其对Tca8113细胞增殖及侵袭行为的影响，并检测了相关信号通路、细胞周期及凋亡相关蛋白的表达情况。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　Tca8113细胞系来自上海交通大学附属第九人民医院馈赠，rAd-p53、带有绿色荧光蛋白标记的腺病毒（recombinantadenovirus-greenfluorescentprotein，rAd-GFP）注射液（规格为每支1×1012vp，深圳赛百诺公司），CCK-8细胞毒性检测试剂盒（同仁化学研究所，日本），Transwell细胞侵袭试剂盒、ECL发光底物（密理博公司，美国），兔抗人P53、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threoninekinase，AKT）/磷酸化丝 　　氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphor-serine/threonineki- 　　nase，pAKT）、细胞外调节蛋白激酶（extracellularre-gulatedproteinkinases，ERK）/磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphor-extracellularregulatedproteinki- 　　nases，pERK）、P38/pP38、c-jun氨基末端激酶（c-junN-terminalkinase，JNK）/磷酸化c-jun氨基末端激酶（phosphor-c-junN-terminalkinase，pJNK）、细胞周期素D1（CyclinD1）、P21、Bcl-2和GAPDH抗体及鼠抗兔二抗（SantaCruz公司，美国），细胞周期检测试 　　剂盒、蛋白提取试剂盒（南京凯基生物有限公司）。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞的培养和分组Tca8113细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中贴壁生长，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代。根据所加试剂不同分为3组。1）空白对照组：所加试剂为培养液；2）rAd-GFP组：所加试剂为rAd-GFP病毒液；3）rAd-p53组：加入rAd-p53病毒液。 　　1.2.2腺病毒转染率（multiplicityofinfection，MOI） 　　的确定将Tca8113细胞接种至96孔板中，接种细胞密度为每孔3×104个。rAd-GFP、rAd-p53分别按50、100、200、500、1000病毒颗粒/细胞进行转染，每组3个复孔。轻轻混匀使病毒与细胞充分接触，然后把培养板放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。在转染的最初1h内，每隔15min轻轻摇动培养板1次。48h后，在倒置荧光显微镜下每孔分别随机选择3个200倍视野计数呈现绿色荧光的绿色荧光蛋白（greenfluo- 　　rescentprotein，GFP）阳性细胞数，在可见光下计数该视野内的总细胞数，根据公式计算转染率，转染率=GFP阳性细胞数/该视野内总细胞数×100%。 　　1.2.3细胞增殖实验取对数期生长良好的细胞，以密度为每孔1×104个