蓝耳病毒含量测定[1].pptVIP

PRRS病毒含量测定病毒制品检测室 猪病组 能力比对试验 PRRSV病毒特性 有脂质囊膜，对乙醚和氯仿等脂溶剂敏感； 在低温下能保持稳定的感染性，但不耐热，56℃处理15~20min，37 ℃处理10~24h， 20℃放置6d或4℃保存1m，病毒滴度将下降10倍。 56℃处理45min，或37 ℃处理48h，病毒可彻底灭活。 PRRSV培养和增殖 原代猪肺巨噬细胞：病毒增殖较快，CPE1~4天出现，主要表现为细胞圆缩、聚集和快速崩解； 传代细胞系：非洲绿猴肾细胞CL2621、MA104和Marc-145 CPE发生较缓慢,一般在感染后2～6天。首先感染细胞呈进行性的细胞溶胀并形成小圆形的细胞丛,接种2～4天后大量感染细胞核圆缩,细胞空泡化并脱落,至5～6天CPE波及整个细胞单层,出现密集小裂隙 ，最后脱落。 在Marc-145细胞上的病变现象 病毒含量测定 1、 检验器具 75 cm2、175cm2细胞培养瓶，96孔细胞培养板，1.5ml离心管、Tip头（1ml、200ul），离心管架，冰盒，记号笔等。 2、仪器设备 恒温培养箱、生物安全柜、二氧化碳培养箱、高速离心机、电子精密天平、单道微量移液器（100-1000μl）、单道微量移液器（20-200μl)；八道P300微量移液器（100-300μl)、普通光学显微镜。 病毒含量测定用细胞 Marc-145细胞：猴肾细胞，从母细胞（MA104）克隆而来。 生长培养基 DMEM（高糖型，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）， 8~10%胎牛血清，双抗 细胞健康生长注意事项 无支原体等外源因子感染； 培养液pH在7.0~7.3，以7.2为佳; 一般按1：3传代，细胞接种密度为1.5~2.0×105/ml，36~48h长成单层; 血清质量可靠、稳定; 细胞及时传代，一般在72±6h; 细胞传代时消化液用胰酶+EDTA，消化过程应尽可能的缩短； 3、试剂 3.1 细胞培养液：无血清DMEM细胞培养液；含4%胎牛血清的DMEM细胞培养液；含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液； 3.2 血清：胎牛血清 3.3 消化液：0.25%胰蛋白酶+EDTA溶液 3.4 其他：PBS 4、细胞的准备 从液氮中取出Marc-145细胞1支，迅速放入37℃水浴解冻，解冻完全后，1000rpm离心5分钟，倾去上清，将离心沉淀后的细胞用10ml含8%胎牛血清的D-MEM营养液悬浮，分装于1个25cm2细胞培养瓶中，置37℃温箱中培养。连续传2~3代，备用。 5、 细胞板的准备 取长满单层的Marc-145细胞（传代后72h左右），倾弃培养液，用PBS洗细胞两次，加入消化液到培养瓶细胞面对侧，翻转培养瓶平放以确保消化液完全覆盖细胞层。静置15～30s，弃去大部分消化液，只保留少量消化液，置37℃温箱。待消化完全后加入少量含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液，吹打细胞使其分散，按细胞培养时1：3的体积比例制成细胞悬液（细胞浓度约为15万～20万/ml），混匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μl，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。 6、 样品的稀释 将冻干样品先用5ml无血清D-MEM营养液稀释成4头份/ml，再做4倍稀释（即取1ml加入到3ml无血清D-MEM营养液中，即为1头份/ml）。然后再做10倍系列稀释，即0.1ml样品加入到0.9ml无血清D-MEM营养液中，涡旋混合均匀，如此连续稀释，取10-3 、10-4 、10-5 、10-64个稀释度进行测定。 注：样品稀释过程应尽量在低温条件下进行 7、 测定 将稀释好的样品加到制备好的已长成Marc145细胞单层（36-48h，一般不要超过48h）的96孔细胞板上，每个稀释度6孔（为避免边缘孔效应，细胞板四周细胞孔不做检测用），每孔100μl 。同时设立正常细胞对照6孔。加样顺序应按照先加正常细胞对照，再由高稀释度到低稀释度加入细胞板。 细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中吸附1h后，补加含4%胎牛血清的DMEM细胞培养液100μl，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，连续观察至第5日，判定结果。 8、 TCID50计算 * * PRRSV核酸为单股RNA，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。 * 病毒粒子呈球形，20面对称，有囊 膜，无血凝性 病毒在猪肺泡巨噬细胞内复制 健康的猪肺泡巨噬细胞 感染了PRRSV的猪肺泡巨噬细胞 正常Marc-145细胞（ⅹ100） 72h左右，细胞开始圆缩，聚集，并呈灶状脱落（ⅹ100） 5d左右，细胞大片裂解脱落（ⅹ100） 根据Reed-Muench法计算TCID50 。举例说明计算方法： logTCID50=高于50%的病毒