专题1基因工程讲义教材.pptVIP

;限制性核酸内切酶——“分子剪刀” DNA连接酶——“分子缝合针” 目的基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” ;限制酶;区分：黏性末端和平末端;连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 E·coli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。;载体必须具备的条件： 1、能够在宿主细胞中稳定地保???并复制； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、荧光蛋白基因等 ） 4、对受体细胞无害;质粒;获取目的基因;（一）、目的基因的获取;上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？; 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。;质粒;问：限制酶Mun Ⅰ和限制酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如右图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因运载体的质粒是 ; （3）基因工程中常用的受体细胞有——原核的：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等;真核的：酵母菌、植物细胞、动物受精卵等。 ;.农杆菌转化法——一般用于双子叶植物和裸子植物;显微注射技术;. 过程;（四）、目的基因的检测与鉴定;如：DNA分子杂交示意图 ;1.Southern杂交用于分析DNA ;1.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交——适合于核酸样品的定性检测，而不是定量检测。 2.原位杂交——菌落、噬菌斑以及真核细胞原位杂交。;30．基因芯片的测序原理是通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。先在一块基片表面固定序列已知的核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的靶核酸序列，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列;例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。;谢谢！;基因文库定义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 组成：外源DNA片段、载体和宿主细胞;. 基因文库的构建;提取某种生物的全部DNA;目的基因的mRNA;IMN;(2)利用PCR技术扩增目的基因;① 概念：PCR全称为_______________，是在生物____复制___________的核酸合成技术 ;⑥过程：;蛋白质的氨基酸序列; 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌、变性等处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点的连接;目的基因;cDNA文库 (cDNA library)