中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达研究报告.pptVIP

中国人肥胖基因的克隆、 序列分析及在大肠杆菌中的表达;肥胖基因概述及发现;脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用 新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11 000g 4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11 000g 4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀，7 500g 4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl 无RNase的双蒸水溶解。（冷冻-离心-保存）;反转录PCR（PCR扩增） 根据已报道的序列设计引物，即将编码成熟肽的第二个密码子CCC 转变为大肠杆菌常见密码子 CCG: P1：5’-AAC GAA TTC ATG GTG CCC ATC CAA AAA GTC CAA-3’ P2：5’-TTT GGA TCC TCA GCA CCC AGG GCT GCG GTC-3’ 以提取的RNA与P2引物70℃共同孵育5分钟后置冰浴。第一链cDNA合成反应体系为200u AMV反转录酶，5μl 5×缓冲液，1μl RNasin，2μg RNA，四种dNTP(各250μmol/L)。100pmol/L P2引物，总体积25μl,37℃，1小时。取5μl cDNA产物进行PCR扩增，反应体系为5u Taq酶，5μl 10×缓冲液，四种dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，总体积50μl,94℃ 5分钟后行PCR扩增，循环条件为94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35循环后72℃延伸10分钟，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。 ;肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析 　用测序载体pUC19顺利地对肥胖基因PCR产物进行了克隆。通过ABI 377荧光自动化测序，证明其序列与报道的白种人完全一致。 ;肥胖基因的原核表达 　　用EcoR I和Sal I将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEX HTa 质粒(图1)。pPROEX HTa重组质粒转化大肠杆菌（E.coli） DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3 ml LB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30 ml LB中，37℃振摇培养3小时，使OD600约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS电泳。;将肥胖基因克隆入pPROEX HTa六聚组氨酸融合表达载体，获得表达的蛋白分子量为17.5 Kd，表达量高达20%左右。 用所得的瘦蛋白可以进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病。;特别说明;实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人完全一致，可见该基因在人种间可能没有差异，属于高度保守序列，在功能上有极其重要的作用。 对肥胖基因的原核表达，起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核表达载体，但未获得表达。后将其克隆入pPROEX HTa六聚组氨酸融合表达载体，结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可给产物纯化工作带来便利，只须用相应的亲和层析系统即可达到高质量的纯化。 我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆，并通过核苷酸顺序分析证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们得到的基因可用作探针，用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核表达载体，在大肠杆菌中表达，所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究，也可进一步探讨肥胖基因的作用机制。;谢谢欣赏！;;1　PCR分子量标准　PCR molecular weight marker 2　RT-PCR扩增产物　RT-PCR product 箭头所指为肥胖基因条带　Arrow indicates the obese gene band;肥胖基因的分子克隆及酶切鉴定 ;ATGGT GCCCA TCCAA AAAGT CCAAG ATGAC ACCAA AACCC TCATC AAGAC AATTG TCACC AGGAT CAATG ACATT TCACA CACGC AGTCA GTCTC CTCCA AACAG AAAGT CACCG GTTTG GACTT CATTC CTGGG CTCCA CCCCA TCCTG ACCTT ATCCA AGATG GACCA GACAC TGGCA GTCTA CCAAC AGA