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直接获取生物组织内部磷脂类物质的质谱分析方法论文 　　 　　1引言 　　 　　磷脂类物质及其代谢物具有重要的生理功能在细胞生长分化、凋亡吞噬、能量储存、信号传递等生理过程起到重要作用磷脂作为细胞膜的主要组成成分在细胞中的含量相对较高是单细胞领域研究备受关注的物质之一由于很多疾病的发生、发展都与体内磷脂类物质含量的变化、代谢紊乱等密切相关可作为一些疾病的生物标记物因此尽可能全面地得到生物组织样品中磷脂类物质信息’对揭示其在生命体内的作用机制、寻找疾病的分子标志物及医药研发等方面具有重要意义 　　 　　然而由于磷脂类物质种类繁多相互作用复杂传统的分析技术检测复杂样品（如血浆、组织）中磷脂类物质时一般都要经过分离、纯化、提取等复杂的样品预处理过程不仅耗时较长而且可能带来不确定因素直接质谱分析技术如电喷雾解吸电离（DESI)、激光消融电喷雾电离（LAESI)等因其无需样品预处理、样品耗量少、响应速度快、灵敏度高等可实现生物组织样品中多种磷脂类物质的同时、直接、快速识别这些方法主要分析组织样品表面的磷脂无法实现对整体组织样品内部磷脂的直接检测 　　 　　内部萃取电喷雾电离质谱(iEESIMS)技术直接将萃取剂导人到组织样品内部’可实现组织样品内部小分子代谢产物等组分的直接质谱分析本研究采用iEESIMS技术在无需样品预处理的条件下考察了21种不同组成的CH3OHH2O溶剂体系获得％0仏％0(30:70,V/V)为适合不同生物组织样品中磷脂类物质分析的最佳溶剂’建立了一种无需破坏、研磨即可获取生物组织样品内部磷脂类物质的质谱学新方法 　　 　　2实验部分 　　 　　2.1仪器与试剂 　　 　　内部萃取电喷雾电离源（iEESI)为本实验室自制；LTQXL线性离子阱质谱仪并配有Xcalibur数据处理系统（美国ThermoScientific公司）；质谱仪设置在正离子检测模式下质量扫描范围为m/z50~2000,离子源电压5.5kV,离子传输管温度为150T毛细管电压为10V透镜电压为100V;在进行串联质谱分析时设置碰撞能量为10?30%,碰撞时间为30ms,母离子隔离宽度为1.5Da;其它检测参数由LTQTune系统自动优化得到石英毛细管（内径0.10mm外径0.19mm美国AgilentTech?nologies公司）;甲醇(色谱纯美国ROE公司）,实验用水为二次蒸馏水 　　 　　2.2实验方法 　　 　　iEESIMS的实施方式如图1所示将石英毛细管平行插人组织样品内部插人组织样品内部的石英毛细管前端距离样品前沿约2mm,样品前端与质谱人口的距离为5?6mm萃取溶剂以0.5^L/min的流速通过石英毛细管流经组织样品内部并在 　　 　　组织样品内部进行选择性萃取在微量进样针的钢针部位施加5.5kV正高压在电场的作用下样品前端产生大量承载待测物的微小带电液滴这些微小带电液滴去溶剂化后得到气态待测物离子引人质谱仪检测 　　 　　本研究所用实验样品人体肺癌组织（包括癌意图症组织与癌旁组织（距离癌症组织中心约5cm))Fig.1SchematicdiagramofinternalextractiveelectrosPray和食管癌组织由南昌大学第二附属医院提供其iTOiZatiTO(iEESI)maSSSpectr0metry它组织样品如猪肺、猪肉、牛肉、猪心等购自当地市场所有样品均储存于80°C超低温冰箱中在进行iEESIMS分析前将样品取出室温下解冻样品无需其它处理即可直接进行iEESIMS实验在优化实验中以不同体积比的CH3OHH2O萃取每种样品平行检测至少3次确保实验结果的重复性 　　 　　3结果与讨论 　　 　　3.1萃取溶剂优化 　　 　　为了全面获取组织样品中磷脂类物质信息选择合适的萃取溶剂对提高分析方法的性能具有重要意义目前最常用的脂类物质萃取方法是传统的“金标准”法即Folchorblighanddyerrecipes法该方法采用CHClgC^OHGaV/V)混合液为萃取溶剂但氯仿具有致癌性且降解产生光气、氯化氢气体可能使一些不稳定磷脂类物质发生化学修饰影响检测结果的准确性有文献报道改进的二氯甲烷甲醇（C%%CH3OH)、甲基叔丁酰乙醚甲醇（MTBECH3OH)[1]等可用于组织样品中脂类物质的提取但这些体系均不适于质谱进行直接检测显然在质谱分析中萃取剂既是该待测物的电喷雾液滴也是影响物质萃取效率的重要参数不仅所选溶剂本身的化学及物理性质在一定程度上影响获得的分子信息而且目标物离子化效率受到溶剂组成和其本身在溶剂中溶解度的影响相似相溶的规律依然适用 　　 　　实验选用不同体积比的C^OHH2O(0?100%)为萃取溶剂选择肺癌患者的癌症与癌旁组织为实验样品按2.2节实验方法测定组织样品中的磷脂类