白腐真菌生物技术与应用讲义资料.ppt

以黄孢原毛平革菌的分离为例 担子菌的筛选 利用选择培养基初步分离担子菌类（粗筛） 常用选择培养基配方 干燥的麦芽汁提取物 3.0g 真菌蛋白胨 0.5g 琼脂 2.5g 蒸馏水 100mL 邻苯基苯酚 0.006g 注意点： 1、邻苯基苯酚的浓度可以根据具体情况进行调节，最大 浓度≤0.01%（质量浓度）； 2、使用乳酸调节培养基pH值，不影响对担子菌的筛选； 优点： 能从受霉菌严重污染的土壤及其他介质中分离担子菌； 真菌耐药性试验 细筛 利用担子菌对各类天然和合成杀真菌物质的忍耐性，进一步从筛选 体系中去除可能残留的细菌和放线菌。 常用的杀真菌物质为玫瑰红（四碘四氯荧光素），一般使用浓度30mg/L。 担子菌的纯化 使用苯菌灵-麦芽琼脂培养基对培养物进行进一步培养（纯化） 纯化的目的：是要去除培养物中可能存在的其他丝孢菌类（hyphomycetes）； 苯菌灵母液的配制：1g的50%苯菌灵粉末，加到500mL的蒸馏水中； 一般使用浓度与方法：将母液按照1mg/L的浓度加入2%（质量浓度）的麦芽琼脂培养基中； 担子菌的分离 以Poly R-478为指示剂分离能降解木质素的菌种（分离） 常用分离培养基配方 大麻茎木 0.2%（质量浓度） 琼脂 1.5 %（质量浓度） 苯菌灵 15mg/L 愈创木酚 0.01 %（质量浓度） 分离 使用0.02%（质量浓度）含Poly R-478 （聚合染料）的平板麦芽琼脂培养基 培养分离菌种 检定 使愈创木酚变成褐色的菌为目标菌种 使含Poly R-478的平板麦芽琼脂 培养基脱色即可确认分离成功 具体菌种的纯化 根据需要筛选的特定菌种类型，使用与之匹配的选择性分离培养基，对培养物 反复多次培养，直至获得目标纯菌种，然后采用16sRNA检测鉴定。 问题 假设已经获得某种白腐真菌的子实体，可以采取何种方法分离出纯菌种？ 培养 各类真菌子实体 切割 获取子实体块 PDA培养基 植入 获得菌丝体 菌丝体纯培养 2-2 具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选 筛选的必要性 白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程 中其木质素降解条件很难得到满足。因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的 白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义。 筛选的基本策略 理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析 之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性。 利用聚合染料的筛选程序（常用） 指示染料的选择 选择培养基 异生物质的降解与染料脱色相关性判断 2-3 白腐真菌木质素降解性能的鉴定 白腐真菌木质素降解酶的平板定性 方法一 Poly R-478指示细胞外氧化酶 在平板上补充0.02%（质量浓度） Poly R-478，用于检测细胞外氧化酶。现象：平板脱色 方法二 平板系统定性测试木质素降解酶 加入250mg/L的ABTS，菌丝周围形成黑绿色环， 指示Lac和过氧化物酶存在 加入0.1g/L的MnCl2·4H2O，平板上形成黑棕色斑 点，指示MnP的合成 平板测试系统 agar-plate test system 25g/L琼脂 35mL 接种直径10mm 的琼脂菌丝块 ABTS-平板 Mn-平板 腐殖酸-平板 加入1g/L的煤腐殖酸，平板上发生漂白反应，指 示木质素降解酶的系统的存在 白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定 这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法。 经典培养基 PDA培养基 去除土豆滤液 基本琼脂培养基 BAM培养基 ABTS-琼脂培养基 SYR-琼脂培养基 Mn-琼脂培养基 加入100mg/L的ABTS 加入100mg/L的MnCl2·4H2O 加入100mg/L的 丁香连氮（吖嗪） 加入10mL的各培养基，并植入5mm的琼脂菌丝块，每2～3日检测色变区和菌的放射性生长 菌丝周围形成深绿色 1周后在菌丝周围积累 紫色醌类物 2周后形成黑棕色的 MnO2条纹 3、白腐真菌反应体系的建立 白腐真菌反应体系的种类 平板反应体系 液体反应体系 静置反应体系 摇床反应体系 主要用于酶和降解的定性研究 主要用于酶学研究和降解 反应的定性定量研究 建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（6大因素） 培养基 经典培养基的组成（L-1） 0.2g KH2PO4 0.05g MgSO4·7H2O 0.01g CaCl2 1mL 无机溶液 0.5mL 维生素溶液 1.2mmoL 酒石酸铵（氮源） 56mmoL 葡萄糖（碳源） 20mmoL DMS（缓冲成分） pH 4.5 维生素