毕业论文设计《鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究》.doc

鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究 l 分类号 学校代码 10426 密 级 学 号 2009050611 硕 士 学 位 论 文 MASTER DEGREE THESIS 鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的 鉴定及功能研究 学 生： 指导教师： 副教授 副研究员 学科专业： 海洋化学 专业代码： 研究方向：微生物与分子生物学 年4月15日 鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究 学位论文完成日期：____________________ 指导教师签字：____________________ 答辩委员会成员签字：____________________ ____________________ ____________________ ____________________ ____________________ ____________________ 鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究 摘 要 生物体内普遍存在的多胺转运系统PotABCD运载体由四个功能蛋白组成：PotA是三磷酸腺苷酶，为转运系统提供能量；PotB和PotC可在双层膜上形成转运通道；PotD是一种胞质结合蛋白，有一个多胺识别区域，对亚精胺有较高的亲和性，对腐胺亲和性较低。 鳗弧菌（Vibrio anguillarum）M3中发现了编码亚精胺结合蛋白的三个推定potD基因：potD1、potD2和potD3。为了研究这三个基因在鳗弧菌M3亚精胺转运中起到的作用以及对致病性鳗弧菌M3毒力的影响，本研究利用框内缺失技术构建了potD1、potD2和potD3单基因缺失突变株和多基因缺失突变株，同时利用细菌的接合转移技术，以低拷贝克隆质粒Pmmb207为载体，构建了突变株的互补株。 在排除了鳗弧菌自身合成对胞内多胺含量影响的化学定义的最低培养基M9中，potD1或potD3基因的单独缺失或同时缺失突变株中多胺的含量与野生型鳗弧菌M3相比明显降低，并且其生长速度也明显下降，说明potD1和potD3基因能够参与鳗弧菌M3多胺的转运过程，是鳗弧菌中亚精胺结合蛋白的编码基因。potD1和potD3基因通过对多胺转运过程的影响间接的影响了鳗弧菌的生长能力以及对鱼的致病能力。potD2基因与potD1和potD3基因之间存在拮抗作用，potD2基因的单独缺失不会影响鳗弧菌胞内多胺的含量，虽然它不参与亚精胺转运蛋白的编码，但是potD2基因能在一定程度上抑制potD1和potD3基因的表达，所以它的单独缺失或与potD1、potD3的同时缺失能不同程度的改变鳗弧菌的生长能力和毒力等。实时荧光定量PCR的方法进一步的验证了上述基因在突变株中的表达情况，并确定鳗弧菌性状的改变是由基因表达量的变化引起的。 关键词：鳗弧菌 亚精胺结合蛋白 基因功能鉴定 THE IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL STUDY OF SPERMIDINE BINDING PROTEIN GENE IN VIBRIO ANGUILLARUM ABSTRACT The widespread polyamine transport system PotABCD transporter in vivo is composed by the four functional proteins: PotA, ATPase, provides energy for the transport system; PotB and PotC can form transport channels in the double membrane; PotD,which is a cytoplasmic combination protein with a polyamine recognition domain, has a higher affinity for spermidine and lower affinity for putrescine. Three presumptive potD genes that encode spermidine binding protein PotD in Vibrio anguillarum M3: potD1, potD2 and potD3. In order to study the role of these three genes in Vib