第二章基因工程的工具酶.pptVIP

第二章 基因工程工具酶 1.工具酶的概念 应用与基因工程的各种酶的总称. 大量应用的是核酸酶. 切: 限制性内切酶 连: DNA连接酶 修饰酶，聚合酶 /listplay/sJj53SXK_PQ/-TXTvgODA4I.html /listplay/sJj53SXK_PQ/u-6RLhVXzv0.html?FR=LIAN 几乎所有细菌均可产生限制性内切酶。 1962年，瑞士的W. Arber提出限制与修饰假说。 限制性内切酶：识别特定序列 DNA甲基化酶：甲基化该特定序列，保护细菌DNA 2.限制性内切酶 I型：随机切割，核酸内切酶，甲基化酶，ATP酶，DNA解旋酶 II型：仅识别特定DNA序列，广泛应用 III型：具有限制和修饰双重作用，应用较少 限制性内切酶的命名 基本名称 具该酶的机体属名的第一个字母（大写） 种名的前两个字母（小写） 大肠杆菌 Escherichia coli 流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 短杆菌 Brevibacterium albidum 粘质沙雷式菌 Serratia marcescens 同一菌种具有不同的菌株或菌型 基本名称 菌株或菌型(小写) 大肠杆菌k型菌株 Ecok 流感嗜血菌d型菌株 Hind 限制酶由染色体外的成分，如病毒、质粒等引起 基本名称 质粒、病毒的辅助字母 EcoR 某一菌株具有多个不同的限制酶体系，用罗马字母表示发现的先后顺序 Hind II: EcoR I: 有的限制酶前冠以系统名 R ：限制性核酸内切酶，常省略 M：甲基化酶 R. Hind III M. Hind III 限制酶的识别位点 II型限制酶的识别系统 识别4~6个碱基对，一般富含GC；少数识别6个以上的碱基对，为稀有酶 识别序列具有回文结构 识别序列严格，少数仅识别一二位专一 限制酶剪切方式 产生5’突出的黏性末端 产生5’突出的黏性末端 产生平齐末端 II型限制酶的反应条件 U-一个单位的限制性内切酶 合适的温度和缓冲液，20 ul体系，1 h降解1ug DNA所需酶量 注意酶的稀释与保存 影响限制酶活性的因素 DNA纯度 DNA甲基化程度 酶切反应的温度 DNA的分子结构 缓冲液 3. DNA连接酶 连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 在DNA复制、修复及体内外重组过程中起着重要作用。 连接机理 一条DNA链上的3’游离羟基与另一条DNA链上的5’末端磷酸基团形成3’,5’-磷酸二脂键。 DNA连接酶的种类 (1). T4噬菌体DNA连接酶 不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。 (2). E.coli DNA连接酶 不能连接平端DNA,不能连接RNA。 T4噬菌体DNA连接酶 广泛应用，可以连接： 两个带有互补黏性末端的双链DNA分子 两个带有平头末端的双链DNA分子 一条链带有切口的双链DNA分子 RNA-DNA杂合体中RNA链切口，RNA末端与DNA连接 DNA连接酶反应体系 12~30℃下反应1~16h。 黏性末端：12~16℃，保证退火、酶活性、反应速率间的平衡 平头末端：10~20℃，10~100倍酶量 终止反应：EDTA或75℃水浴 影响连接反应的因素 DNA末端的结构 DNA片段浓度 相对分子量 反应温度 离子浓度 4. DNA聚合酶 催化合成DNA的反应的酶 DNA聚合酶分类 依赖DNA的聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶 T4 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶 逆转录酶 依赖DNA的DNA聚合酶 (1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)： 具有三种酶活性 a、5’ ---3’DNA聚合酶活性 CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ dNTP GGCTATCGGA b、3’ ---5’ 外切酶活性-校正作用 CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCG GCG Mg2+ dNTP GCG c、5’ ---3’外切酶活性 CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAG GCGTAATC Mg2+ GCGTAATC 大肠杆菌DNA聚合酶I制备杂交探针。 Mg2+，低浓度DNA聚合酶I，同位素标记的核苷酸处