第3章基因工程制药技术.ppt

② 穿梭载体(shuttle vector): 是一种既能在原核细胞又能在真核细胞中复制和表达的载体，由反转录病毒的LTR、包装信号和质粒的复制起始点、筛选元件等成分重组而成。由于此类载体缺乏反转录病毒的结构基因，需要野生病毒提供结构蛋白，以形成有感染力的重组体。目前此类载体已成为表达外源基因的重要基因工程载体。 1. 用反转录病毒作为载体需要相应的包装细胞，以形成完整的体系。 2. 包装细胞提供结构蛋白，与带有外源基因的重组反转录病毒载体分子一起生成能高效感染靶细胞的病毒颗粒。 反转录病毒载体的作用条件： 目前常用的反转录病毒载体有多种，例如经Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV)改造构建成的载体，其宿主广泛，传染率极高，是目前最常用的反转录病毒载体。 包装细胞也有多种，均由稳定的小鼠成纤维细胞系或QT6鹌鹑细胞系衍生而来，如第一代的ψ-2、ψ-am；第二代的PA3l7；新一代的ψCRIP，原则上包装细胞应避免产生具有复制力的野生型病毒。 SV40(Simian virus 40)(猴肾病毒)载体 SV40是一种小型球状病毒，其基因组为共价闭合环状双链DNA，长5243bp，编码5种蛋白质。SV40病毒颗粒可直接作为克隆载体使用，外源DNA以置换的方式取代SV40的晚期区和早期区形成重组体。 直接用作克隆载体时存在许多缺点，因此目前已对其进行了相应的改造，衍生出一系列的SV40载体，能在多种哺乳动物细胞中表达，对基因组DNA和cDNA均能表达，对插入的外源基因大小无限制。 目前常用的SV40衍生载体有pSVT7、pMT2等，它们都可进行外源基因的瞬时表达，广泛用于基因表达研究的各个领域。 昆虫病毒载体： 目前最常用的昆虫病毒载体是杆状病毒载体系统 。 杆状病毒(baculo virus)是一种大型、有包被的双链DNA病毒，主要感染节肢动物。 杆状病毒载体的特点： 是真核表达系统，可直接进行蛋白修饰加工； 重组区是病毒生长非必需区， 基因组较大，可插入的外源DNA片段较大； 含有一个强包含体蛋白启动子 不感染脊椎动物，比较安全； 4. 酵母人工染色体载体： 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)载体可克隆和分离的DNA片段达l000kb。 由于YAC系统作为载体其容量大，故能保持克隆基因的完整性，而且利用YAC构建人类的基因组文库，只需数千个重组体即可满足需要。 YAC的调控元件： (1)着丝粒(centromere)，以保证染色体在分裂过程中能正确分配到子代细胞。 (2)端粒(telomere)，作为染色体复制所必需的成分，能防止染色体被核酸外切酶降解， (3)复制起始点、限制性酶切位点和筛选标记。 (4)原核序列及调控元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以利于在大肠杆菌中操作。 重组DNA技术的基本过程 第三节 目的基因的分离与制备 第四节 目的基因的体外重组 第五节 重组子导人宿主细胞 第六节 阳性重组子的筛选和鉴定 第三节 目的基因的分离与制备 一、通过基因组文库分离、筛选基因 二、cDNA文库分离、筛选基因 三、人工合成基因 四、应用聚合酶链反应获取目的基因 五、高通量获取目的基因 一、通过基因组文库分离、筛选基因 基因组文库(genomic library)是指用基因克隆的方法保存在适当宿主中的DNA重组分子的集合，所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核酸序列。基因组文库的构建是将细胞中的基因组DNA切割成一定大小的片段，与合适的载体(λ噬菌体、质粒、YAC系统等)进行重组，并转化宿主细胞。 在进行任一基因筛选时达到99％以上的概率，这种方法类似于霰弹打鸟，因此也称为鸟枪法 。 要从如此庞大的文库中筛选出某一特定基因十分困难，尤其是单拷贝基因。随着分子生物学技术的发展，如分子杂交及探针技术的应用等，从基因组文库中筛选出特定基因已无大的困难。 二、cDNA文库分离、筛选基因 cDNA文库(cDNA library)是指利用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。 cDNA文库是以mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA，经双链化后与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的。 cDNA文库中的插入片段是由mRNA逆转录生成，可直接指导转录和翻译。 亦即针对不同的组织或细胞所建立的cDNA文库代表各自特定的mRNA表达谱。 基因组DNA文库 cDNA文库 三、人工合成基因： 知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息