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第四章 细胞培养与代谢调控 一、细胞培养概述 细胞培养是指从体内组织分离细胞，模拟体内环境，在无菌、适当条件下使其生长繁殖一种技术。细胞培养的对象是单个细胞或细胞群。 细胞培养影响的环境因素：营养、pH、渗透压、溶解氧、光照、剪切力等。 二、细胞培养的操作方式 根据细胞培养时营养成分添加以及培养液与细胞收集方式的不同，细胞培养有：分批式、流加式、半连续式、连续式和灌流式5种操作方式。 1、分批式培养 分批培养是指细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养，在培养过程中培养液体积不变，不添加营养成分，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性收获细胞、产物和培养液的方法。 特点： （1）操作简单，培养周期短。 （2）直观反映细胞生长代谢过程。 （3）可直接放大。 缺点：不能控制底物浓度、细胞容易老化、生长周期短、效率低等 2、流加式培养 分批培养是指在分批培养过程中，间歇或连续地不加一种或多种营养成分的培养方法。 与分批培养相比，其具有以下优点： （1）可根据细胞生长速率、营养消耗情况，保证合理、充足的营养。 （2）可以减少产物反馈抑制，排除有害代谢产物积累带来的细胞损伤。细胞不易老化。 （3）可以避免在分批培养终因一次投料过多造成的底物抑制等影响，改善培养液流体学性质。 （4）可以延长指数生长期，从而提高细胞密度，延长细胞培养周期。产物浓度较高，又能实现连续收获。 单一补料，反复补料。 3、半连续式培养 半连续式培养又称重复分批式培养或换液培养在细胞增长和产物形成过程中，每隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原体积，是反应期内的总体积不变。每次稀释培养体积的1/2~3/4。 特点： （1）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间。 （2）可进行多次收获。 （3）操作简便，生产效率高。 4、连续式培养 连续式培养是在细胞达最大浓度以前，以一定速度向反应器连续添加新鲜培养液，同时含有细胞的培养液以相同速度连续从反应器流出，以保持培养体积恒定的培养方式。 特点： （1）细胞能在恒定状态下生长，营养物质浓度、产物浓度、pH基本卡保持恒定细胞浓度以及生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数生长。 （2）稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。 5、灌流式培养 灌流式培养是指把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地取出部分培养液，同时又连续不断地补充新的培养液。与连续式操作的不知处在于取出培养液时，细胞均保留在生物反应器内。 特点： （1）细胞截留系统可使细胞保留在生物反应器内，维持较高的细胞浓度。 （2）能使细胞处在较稳定的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低。 （3）反应速率容易控制，培养周期长，可提高生产效率，目标产品回收率高。 （4）产品在反应器内停留时间短，可及时回收，有利于保护产品的活性。 三、细胞培养动力学 细胞培养动力学是研究细胞生长、基质消耗以及产物生成规律的科学，包括细胞生长动力学基质消耗动力学以及产物生成动力学。 分批培养生长动力学 分批培养过程中，细胞生长包括：延迟（适应）期、指数生长期、减速期、平台期和衰退期。 * * 1、细胞培养发展简史及有关概念 1907年，美国生物学家哈里森将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周，并观察了神经突起的生长现象。被称为“细胞（组织）培养之父”。 Carrel1912年提出无菌操作技术，1923年又设计了卡氏培养瓶。 现在，细胞培养技术已经成为现代医学研究中的一项重要的手段。近年来，细胞培养技术在细胞生物学、分子生物学、遗传学、药理学、免疫学、老年学、肿瘤学和病毒学以及临床各学科领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕成果。 1）细胞培养（cell culture） 是指将组织取出后，用化学或物理的方法，将其分散成单个细胞在体外条件下进行培养。细胞在培养的过程中不再形成组织。培养物是单个细胞或细胞群。 从广义上讲，体外(in vitro)培养包括所有结构层次的培养，即器官培养、组织培养和细胞培养。 2) 组织培养（tissue culture） 指从体内取出组织，在体外模拟体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。此时可能有组织分化并保持组织的结构与功能。培养物是组织碎块或器官的一部分。 3）器官培养（organ culture） 指器官的胚芽、整个器官在体外条件下的保存或生长，此时亦能有器官的分化并保持器官的立体结构和功能。 实际上，在体外