谷氨酰胺合成酶测定.docVIP

PAGE PAGE 3 谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 二、实验仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml） 三、实验试剂 （1）提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0）。 内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl（0.1mol/L = 1ml的 36%~38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至250ml； （2）反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）。 内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA。称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； （3）反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）。 反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； （4）显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）。 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml； （5）40mmol/L ATP溶液。 称取0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制） 四、方法步骤 1.粗酶液提取 称取植物材料0.5-1g与于研钵中，加3ml（实际情况作调整）提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下12,000r.min-1离心20min，上清液即为粗酶液。 2.反应　1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000 r.min-1下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取1ml用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（方法待定，试着不用定容直接测，即取样品液1ml，如蛋白含量高，再适当稀释，加考马斯亮蓝5ml，在595nm下测定吸光值，注意应放置10min后在测，在1h内比色完） 4.结果计算 GS活力=A/(P.V.T) 式中 A—540nm处吸收值 P粗酶液中可容性蛋白的质量浓度（mg/mL） V反应体系中加入的粗酶液体积（mL） T反应时间 GS活力是以每毫克酶蛋白在每小时催化生成的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合的产物在540nm处的吸光值的大小来表示 注意：在测酶时，由于各酶活力大小的表示都是以每小时/min产生生成一定量的产物的量来表示，不同的时间长度产生产物的量不同，所以在测量时，要严格控制时间，要保证测同一指标的各批次材料在处理时间（反应时间）要严格一致！！！