抗体标记实验技术.PDFVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 抗体标记实验技术 抗体标记简介 抗体标记是指将标记物 （酶 ，荧光素 ，生物素等 ）共价连接到抗体上 ，与待检测 物 （如某些特定抗原 ）特异性反应形成多元复合物 ，并借助于荧光显微镜、射线 测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接 镜检观察或进行自动化测定 ，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗 原、抗体反应进行定性和定位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中 的半抗原、抗原进行定性和定量测定。目前抗体标记技术己被广泛用于医学病理 学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定 ，常见的抗体标记技术包括酶标记法 ，生 物素化标记法 ，荧光素标记法和胶体金标记法等。 常用的抗体标记技术 1.抗体的酶标记法 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上 ，制成酶标抗体 ，再借酶对底物的特异催化作用 ，生成有色的不溶性产物 或具有一定电子密度的颗粒 ，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查 ，也可以用分光光度计测定 ， 呈色反应显示了酶的存在 ，从而证明发生了相应的免疫反应。 实验中使用偶联剂使酶与抗体结合 ，即通过应用单、双或多功能试剂 ，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发 生反应 ，生成酶—抗体偶联复合物。不同的酶—抗体复合物制备方法中 ，最广泛应用的戊二醛法 ，本法与其它偶联 方法相比 ，具有操作简单、反应条件温和 ，及实用面广等长处。 酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体 ，其次要有良好的制备方法。高质量的抗体则 可通过提取纯化而获得。在制备方法上 ，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行 的方法。 1) 辣根过氧化物酶(HRP) Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 辣根过氧化物酶 （HRP ）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是 HRP的糖基用过碘酸钠氧化 成醛基 ，加入抗体 IgG后该醛基与 IgG氨基结合 ，形成 Schiff 氏碱。为了防止 HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基 发生偶合 ，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了 ，用硼氢化钠稳定 Schiff 氏碱。 操作步骤 ： 将 5mg HRP溶于 0.5ml0.1mol/L NaHCO3溶液中 ；加 0.5ml 10mmol/L NaIO4 溶液 ，混匀 ，盖紧瓶塞 ， 室温避光作用 2小时。 加 0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 加入 0.75ml小鼠已处理的腹水 ，或纯化单抗等 （15mg/ml ），混匀。 称取 Sephadex G25干粉 0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的 5ml注射器外筒内 ；随后将上述交联物移入注 射器外套 ；盖紧 ，室温作用 （避光 ）3小时或 4℃过夜。 (用少许 PBS将交联物全部洗出 ，收集洗出液 ，加 1/20V 体积新鲜配制的 5mg/ml NaBH4 溶液 ，混匀 ， 室温作用 30分钟 ；再加入 3/20V NaBH4 溶液 ，混匀 ，室温作用 1小时 （或 4℃过夜 ）。 将交联物过 Sephadex G200 或 Sepharose 6B （2.6×50cm ）层析纯化 ，