高效液相色谱法进展及在卫生检验中的应用.ppt

四川大学华西公共卫生学院孙成均 高效液相色谱技术进展及其在卫生检验中的应用 四川大学华西公共卫生学院 孙成均 介绍的主要内容 概述 高效液相色谱仪组成及进展 从色谱图的异常推测故障 高效液相色谱法在卫生检验中的应用 一、概述 高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代发展起来的一种分离分析技术，在色谱技术中应用最广。 据估计，世界上数百万种有机化合物中除20%宜用气相色谱法(GC)分离分析外，其余80%（包括大分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物）均可用HPLC分离分析。 自1980年代以来，HPLC 成为国际分析化学界发展最快的一种分离分析技术，在工农业、医药卫生、环境监测等众多领域有广泛应用。 液相色谱的发展简史 液相色谱基本原理 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 分离原理示意图 二、高效液相色谱仪组成及进展 HPLC 仪器一般由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和计算机控制及数据处理系统(工作站)组成。 1．输液系统 对高压输液泵的要求： 密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求；可调范围宽，既能满足微柱(内径1～2mm)分析，也能满足常规柱(内径4mm)分析，甚至还可满足半制备柱(内径10mm)的需求。 目前HPLC 常用的是双泵头往复式柱塞泵，流速范围一般为0.001～10ml/min。它是由两个泵头交替工作来保证系统中液流不中断。 往复式柱塞泵 洗脱方式 等度洗脱（Isocratic Elution）：溶剂组成恒定，在整个洗脱过程，流动相极性保持恒定。 梯度洗脱（Gradient Elution）：流动相组成和极性随洗脱过程而改变。 流动相组成变化对保留时间的影响 泵的保养与维护 高纯流动相（甲醇、乙腈、水、缓冲盐等）； 流动相进液砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 2．进样六通阀 HPLC六通阀进样器的使用及保养 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器应用最广。 进样六通阀使用注意事项 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，转到进样位时，高压力引起柱头损坏，故应尽快转动阀，不能停留在中途。 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。该针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性好，不漏液，不引入空气；还可防止了针头刺坏密封组件及定子。 对进样液的要求 样液要无微粒杂质样液，一般要经0.45 μm滤膜过滤或高速离心。以防堵塞针头及进样阀，减少对进样阀的磨损。 为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗。 3. 色谱柱 色谱柱通常为不锈钢柱，内装不同填充剂。常用填料为硅胶，可用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相色谱或正相色谱。其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS 柱（octadecylsilica column），可用于反相色谱或离子对色谱。 高效液相色谱柱发展史 1970年代，HPLC柱面世，主要填料：10 μm 的无定型硅胶颗粒。 1970年代后期，发展了反相液相色谱。 1980年代，HPLC已广泛应用，主要填料粒径5 ～ 10 μm 球形硅胶。 1990年代早期，发展了粒径为 5 μm 的高纯硅胶（ B 型硅胶），其含有微量的金属（A型硅胶含有高含量金属）。 1990年代后期，发展了 3 μm 或 3.5 μm 的球形硅胶。 2000年后，为适应超快速分离要求，开发出小于 2 μm 的填料，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 正相色谱（normal phase chromatography ） 采用极性固定相如聚乙二醇、氨基与腈基键合相；流动相为相对非极性的疏水性溶剂烷烃类如正已烷、环已烷，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。 反相色谱（reversed phase chromatography） 以非极性载体为固定相，以极性较强的溶剂为