实验 酵母RNA的分离及组分鉴定.docVIP

※实验六 酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶 、吸管 7、滴管8、试管及试管架 9、烧杯 、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、 0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5% 钼酸铵溶液：10% 抗坏血酸溶液：水=1：1：1：2 (V/V)； 11、酵母粉。 【实验操作】 1、溶解RNA 将5 g酵母悬浮于90 ml 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液于150 ml锥形瓶中，在沸水浴中加热30分钟，制成碱提取液，将其冷却。 2、解聚RNA 将冷却的碱提取液离心（6000ｒ/min）5分钟，将上清液用乙酸调节pH至酸性（pH5~6））缓缓倾入30 ml乙醇溶液中，注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（6000ｒ/min）5分钟。弃去清液。 3、洗涤沉淀，抽滤得RNA 采用倾倒法用95% 乙醇洗涤沉淀两一次，即得RNA 。 4、RNA各组分鉴定 （1）水解液制备 取200 mg提取的核酸，加入1.5 mol/L硫酸溶液10 ml，在沸水浴中加热10分钟后即得核酸水解液。 （2）组分鉴定 ① 嘌呤碱的鉴定 取水解液1 ml加入过量浓氨水，然后加入约1 ml 0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的白色银化合物沉淀。 ② 核糖的鉴定 取1支试管加入水解液1 ml，三氯化铁浓盐酸溶液2 ml和苔黑酚乙醇溶液0.2 ml。放沸水浴中10分钟。溶液变成绿色，说明核糖的存在。 ③ 磷酸的鉴定 取1支试管加入水解液1 ml和定磷试剂1 ml，在水浴中加热，溶液变成蓝色，说明有磷酸的存在。