第6章基因工程的酶学基础.pptVIP

3’AAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 反转录酶 Mg2+ dNTP 3’AAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT 3’cDNA 反转录酶 3’ RNA 5’ DNA 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 反转录酶 5’ DNA 3’ 反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 5’ 3’ 6.4 DNA 修饰酶 （一）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 简称末端转移酶 来源：小牛胸腺 特点： 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。 在没有模板链的情况下，可以非特异性的将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’-OH。 可以同聚物加尾 如果以dATP或dGTP为同聚物加尾反应的底物则以Mg2+为首选； 如果以dTTP或dCTP为同聚物加尾，则必需有Co2+存在。 5’ p 3’ HO OH 3’ p 5’ TdT Mg2+ dATP 5’ p 3’ AAAAAA AAAAAA 3’ p 5’ 主要用途： 用于克隆DNA片段：平末端DNA片段的末端加尾连接法 用于DNA片段3’末端标记 平末端DNA片段的末端加尾连接法 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸转移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶和 T4DNA连接酶 （二）T4多核苷酸激酶 基本特性：催化ATP的γ-磷酸基转移到在DNA或RNA的5’-OH末端，使5’末端重新磷酸化。 用于标记DNA或RNA的5’末端 2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化 完全酶切消化：内切酶对DNA序列中全部的识别序列进行切割。 部位酶切：内切酶对DNA序列中所有的识别序列进行不完全切割。 酶切反应注意事项 价格昂贵 决不能用水稀释,以免变性失活。 预先加入除酶以外的所有其他试剂。 取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。 使用无菌的新吸头。 少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。 6.2 DNA连接酶 一、DNA连接酶的发现 DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏合剂” 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类： 依赖ATP的DNA连接酶 依赖NAD+的DNA连接酶 依据其来源可分为三类： T4噬菌体DNA连接酶、 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定DNA连接酶。 二、DNA连接酶的特点 连接反应需要一条DNA链游离的3’-OH，另一条链5’末端具有磷酸基团。 连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅因子和激活因子。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子！ DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），不能封闭失去核苷酸所形成的裂口（gap） 三、DNA连接酶的作用机理 四、影响连接反应的因素 1.反应温度： 黏性末端：4~15℃比较合适 平末端：10~20℃ 2.连接酶浓度： 平末端连接所需酶量较多 黏性末端连接所需酶量较少。 3.ATP浓度 一般情况下ATP最适的终浓度为0.5mmol/L。 当ATP浓度上升至5.0mmol/L时，将影响酶对平末端的连接； 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末端及平末端的连接均有抑制作用。 4.DNA片段末端 6.3 DNA聚合酶和反转录酶 DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端，催化核苷酸的聚合。 分为两类： 依赖于DNA的DNA聚合酶 依赖于RNA的DNA聚合酶-反转录酶 一、DNA聚合酶 Ⅰ. E.coli DNA聚合酶I（polI）-Kornberg酶 1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性：具3’→5’和5’→3’外切酶活性 ①5’-3’聚合酶活性 条件 : Mg2+ dNTP 3’-OH 沿3’ 5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 在体内DNA复制时起校对作用，保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。 ②3’- 5’外切酶活性 可降解DNA：RNA杂合体中的RNA分子 带切除的核酸分子必须