实验二 蛋白质定量测定-徐燕(1).pptVIP

蛋白质定量测定 (一)基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。 Lambert-Beer定律： A=KLC 直接法： 紫外分光光度法(50～100μg) 间接法： 双缩脲法（1～10mg) BCA（二喹啉甲酸）法（20～200μg） Lowry改良法 (1～15μg) 考马斯(Comessie)亮兰结合法（1～10μg） 凯氏定氮法(0.2～1.0mg) * * 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。 操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小； 灵敏度较差，特异性不高。-CONH2、 -CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 * 1．标准曲线的作法 (1) 标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2) 标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3) 标准曲线图的绘制：一般常用光密度一浓度标准曲线。 * 2．标准曲线的作用 (1)标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线。从浓度一光密度直线的直线特性，判断所采用方法的呈色反应是否符合lambert—Beer定律。 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)大批样品分析时，省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。 * 根据三个原则： 1.被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.1- 0.7，以0.2- 0.6最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产生很大的相对误差，反之，过高的光密度则超过直线范围而引入误差。 2.应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易去除的干扰色泽，应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。 3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。 * 试剂 标准管 测定管 空白管 1 2 3 4 5 6 7 蛋白质标准液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测血清样本(ml) 1.0 0.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 * (一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。 (三)从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g/L)。 * 管号 A 值 标准管 测定管 空白管 1 2 3 4 5 6 7 A值 0.000 日期，室温 实验项目 * 1、实验原理（清晰） 2、实验步骤（简略但清晰） 3、数据记录及实验结果计算（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 4、实验结论 5、实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等） 将原始记录置于最后一页，装订一同上交 日期、室温 * 标准曲线 根据Lambert-Beer定律， A与C成正比 配制一系列标准液 C1、C2、C3??， 在?max下，测相应的A1、A2、A3……。 仪器型号 波长 日期 室温 测定物及测定方法名称 mg/ml 酰胺基，甲氨基 * 酰胺基，甲氨基 *