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实验二 蛋白质定量分析 蛋白质定量分析也就是蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：1. 临床检测——血清蛋白浓度测定；2. 科学研究——纯化蛋白的浓度测定； 主要方法 根据蛋白质元素组成——凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法——双缩脲法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法； /wiki/456254.shtml 双缩脲法 一、实验原理——双缩脲反应 OH- 蓝色 紫红色 在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。 测定蛋白质的范围——1~10mg； 蛋白质的双缩脲反应 Cu2+ OH- 优点：操作简便、迅速、受蛋白质的种类性质的影响较小，常用于蛋白质提纯的早期步骤测定。 缺点：灵敏度较差、特异性不高。干扰物有硫醇、具有肽性质的缓冲液(如Tris)等。 二、双缩脲法的优缺点 血清总蛋白的正常值：60~80 g/L 蛋白质的紫外吸收 Tyr Trp 蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质。 其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能进行准确定量。 Lambert Beer’s Law: A=KLC To a specific wavelength, 定量分析法 标准曲线法 根据Lambert-Beer定律， A与C成正比 配制一系列标准液 C1、C2、C3、C4、 C5， 在max下，测相应的 A1、A2、A3、 A4 、A5。 或C (mol· L-1) Ax Cx 实验名称： 仪器 编号 λmax 日期 室温 1.配制5种浓度的标准溶液，确定λmax 2.确定比例尺(约1：1)，描点 3.直线通过原点，直线两边的点分布均匀 4.注明相关项目：实验名称、仪器、编号、波长、日期、室温 标准曲线的制作 1.标准曲线又叫校正曲线或工作曲线，是比色分析法中不可缺少的步骤。 2.做多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定方法可靠性。 3.绘制标准曲线的斜率比较各种方法的灵敏度。 4.进行大批样品分析时，可省略多次计算。 标准曲线的作用(P11) 如表1-2-2（P16） 混匀各管，在37度水浴保温20分钟； 调波长为540nm； 用空白管调零； 读ABS 以吸光度（A）为纵坐标，以蛋白质浓度（g/L）为横坐标在坐标纸上绘制标准曲线； 求待测血清样品的蛋白质浓度(标准曲线法)； 取一管与测定管吸光度最接近的标准管进行“标准对照法”求待测血清样品的蛋白质浓度(直接比较法)； 实验步骤 双缩脲法：540nm，玻璃比色杯，vis-7220 紫外法：260，280nm，石英比色杯，uv-9200或者uv-9600或者uv-2000。调节不同波长时需要再次调零。 双缩脲法测定蛋白质浓度 1 2 3 4 5 6 A A 260 280 260/280 稀释倍数 紫外法测定蛋白质浓度 蛋白质浓度(g/L)