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PCR技术的原理及应用 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。 本单位目前开展的工作 多种病原体定量和定性 细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等） 基因表达水平检测 PCR芯片 几种方法总结 实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理 绝对定量与相对定量 绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA） 病毒DNA或RNA的拷贝数 转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含量 差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测 实时荧光PCR绝对定量方法 标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值 使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势 敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品：24，48，96，…… 大范围拷贝数样品同时检测 100 — 1010 省时有效 实时荧光相对定量 相对定量的目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别 内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因 它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 对目的基因进行均一化：目的基因拷贝／每一个内标基因拷贝 Molecular beacon (分子信标) 优缺点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 SNP分析 定量和检测目标基因 任何步骤 有 水解型杂交探针（5‘-3’外切） TaqMan SNP分析 定量和检测目标基因 复性 有 发夹型杂交探针 Molecular Beacon 熔解曲线分析 定量和检测目标基因 复性/延伸 否 结合于双链DNA的小沟中 SYBR Green I 主要应用范围 信号检测 有否淬灭剂 工作原理 化学试剂 unknown 104 103 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X0= - Ct× lg(1+Ex) + lg M (3)