基因工程详解课件(2015版医学、生物学博士课程用).ppt

实验步骤： a. 目的DNA片段插入M13噬菌体载体 b. 以重组噬菌体制备单链DNA c. 设计和合成诱变寡核苷酸引物 d. 诱变寡核苷酸引物和靶单链DNA杂交（退火） e. 利用klenow片段进行延伸反应 f. T4DNA连接酶作用形成双链闭环DNA分子 g. 转化宿主菌 h. 筛选含诱变DNA片段的重组噬菌体 I. 以含诱变DNA片段的重组噬菌体制备单链DNA j. 测序证明M13噬菌体DNA带有目标诱变而无其它诱变 k. 从重组M13噬菌体RF型DNA中回收诱变DNA片段,克隆到其它载体中 实验步骤： （二）PCR 定点诱变法 第八节 重组DNA技术的应用 ①生物制药 ②转基因动物和基因打靶 ③建立疾病诊断方法（基因诊断）。 ④纠正人类疾病缺陷的方法（基因治疗）。 ⑤发展出新的法医学鉴定方法。 一、生物制药 一、制造生物活性蛋白质/多肽药物 包括重组细胞因子、重组激素、重组抗体、重组生长因子、重组受体和粘附分子、重组亚单位疫苗及重组溶栓和抗凝血药物等药物。 （一）重组激素 通过蛋白质工程手段可以提高重组蛋白质的活性、改善制品的稳定性、提高生物利用度、延长在体内的半衰期、降低制品的免疫原性等。 1.重组胰岛素 蛋白质工程 （1）长效胰岛素 B链27位：Thr→Arg A链21位：Asn→Gly 半衰期延长至35.3h (2)快速吸收的胰岛素 B链9位：Ser→Asp B链27位：Thr→Glu 制备单体胰岛素，比六聚体胰岛素吸收快得多。 （3）增加与受体亲和力的胰岛素 B链10位：His→Asp，活性提高5倍。 B26-B30-(B10-Asp,B25-Tyr)去除，活性提高11.7倍。 2.重组生长激素 1985年FAD批准由大肠杆菌表达第一代基因工程GH上市，目前生产的是第二代重组人GH，是分泌型表达产品，与天然蛋白具有完全的一级结构和高级结构，生物活性提高。重组人GH已国产化。 3.重组促卵泡激素 美国已批准人促卵泡激素（FSH）上市，我国亦已批准进口。国产FSH已进入临床试验。 4.重组甲状旁腺素 Eli Lilly公司生产的重组人PTH衍生物含34个氨基酸，与人的PTH的N端序列相同，具有调节成骨和破骨细胞作用的平衡，促进骨质重塑，临床用于治疗和预防妇女绝经后或男性性腺障碍引起的骨质疏松症。国内同类产品已进入临床研究。 （二）重组抗体药物 单克隆抗体：2010年达200亿美元 目前正在开发中的抗体数百种，已有150个产品已进入临床研究阶段。临床适应症以癌症最多，约占50%，其次是自身免疫性疾病，约占18%，感染占13%，心血管疾病占6%，器官移植引起的排斥占5%，其他占8%。 重组抗体 在基因水平对编码抗体的cDNA进行切割、拼接或修饰，甚至将人工合成的抗体基因导入受体细胞表达，产生新型抗体。 重组抗体的主要类别 1.鼠单克隆抗体的人源化 2.小分子抗体(Fab抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽) 3.特殊类型的重组抗体 4.人源化抗体 5.全人单克隆抗体 （三）细胞因子类药物 细胞因子是一类由免疫细胞及相关细胞分泌的具有调节细胞功能的高活性的小分子蛋白质。通过与细胞表面的受体作用后发挥广泛的生物学作用。 1.干扰素 1.干扰素 是一类多功能的细胞因子，由20余种成员组成。新的分类方法将其分为三型：IFN-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。目前这三类IFN的基因工程产品已在世界上多个国家批准上市，值得一提的是IFN-alb是由我国第一个拥有自主知识产权的基因工程产品，也是我国第一个上市的基因工程药物。目前国内有20余家企业生产不同亚型的IFN-α, 成为国内最大的基因工程产业。 2.白细胞介素 是一类介导白细胞间相互作用的细胞因子，现有近30种IL被发现和命名。目前上市的基因工程产品主要有IL-2和IL-11。 重组IL-10分别在不同疾病进入临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验。 重组IL-12作为一种广谱抗肿瘤药物正处于临床研究阶段。 此外重组IL-1和其他重组IL或其激动剂也正处于研究阶段 重组DNA转化过程示意图 （二） 感染（fection） 以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。 感染效率》转化效率