试验一质粒DNA的提取_西安医学院基础医学试验教学中心.pptVIP

* * * * 西安医学院生化教研室 质粒DNA的提取 了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。 实验目的 特点： 超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kb 可插入外源DNA片段，≤15kb 含有标记基因，可使宿主菌获得某些性状，如：amp抗性，tet抗性。 分为紧密型和松弛型质粒 质粒：存在于细菌染色体之外的、具有自我复制 能力的环状双链DNA分子。 plasmid map Experiment Material 碱裂解法抽提质粒DNA的原理： ——染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异 质粒DNA的提取 条件 染色体DNA 质粒DNA pH=12.6 变性 不完全变性 pH=中性 不能复性 复性 离心 沉淀 （染色体DNA+RNA+蛋白-SDS复合物） 存在于上清中 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 质粒的超螺旋结构 培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离 除去细菌染色体DNA、RNA和蛋白质。 无水乙醇沉淀质粒DNA。 实验原理 质粒DNA的提取 主要试剂： solution Ⅰ：50 m mol/L葡萄糖 25 m mol/L Tris-Cl （pH8.0 ） 10 m mol/L EDTA solution Ⅱ: 0.2 mol/L NaOH 1%SDS （新鲜配制） solution Ⅲ: 3 mol/L 醋酸钾 2 mol/L 醋酸 TE缓冲液： 10 mmol/L Tris-Cl （pH8.0 ） 1 mmol/L EDTA （1）取1.5ml细菌培养液至epp管中，10000rpm离心1min。 （2）弃上清，重复一次，倒扣在滤纸片上使液体流尽。 （3）加入100μl溶液Ⅰ，用枪吹散重悬菌体，振荡器上剧烈振荡60s。 （4）加入200μl溶液Ⅱ，快速温和颠倒epp管5次，以混匀内容物（千万不要振荡），室温放置3分钟。 （5）加入150μl溶液Ⅲ，颠倒epp管5次，使沉淀混匀，放置3分钟。　 实验步骤 （6）12000 rpm离心5分钟，转移上清液至一新epp管中。 （7）加入等体积的酚/氯仿 （ 1:1 ） ，振荡混匀， 12000 rpm离心3分钟，吸取上清转移至另一新epp管中。 （8）加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，室温放置3分钟，12000 rpm离心5分钟。 （9）弃上清，加入1 ml 70%乙醇，漂洗沉淀一次， 12000 rpm离心2分钟。 （10）弃上清，将管倒置于滤纸上使液体流尽，干燥10分钟。 （11）加入20-50μl蒸馏水(按沉淀大小而定)，溶解DNA，-20℃冰箱中储存。 超螺旋 开环 线性 实验步骤 挑取单菌落接种到100mlLB液体培养基中（含amp） 放入37℃振荡培养箱内培养过夜 取1.5mL菌液加入epp管 倒掉上清扣干，加入solution I 100uL 离心10000rpm/1min 质粒DNA的提取 剧烈振荡打散菌体 加入solution II 200uL，温和颠倒混匀放置3min 重复一次 实验步骤 加入solution III 150uL, 立即混匀放置3min 离心12000 rpm，5min 小心将含有质粒的DNA上清液移至另一epp管中（以下需轻微操作） 加入等体酚/氯仿 ，振荡混匀 离心12000 rpm，3min 质粒DNA的提取 转移上清液至新epp管 加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀室温放置3min 实验步骤 离心12000 rpm，5min 弃上清液，加入1 ml 70%乙醇洗涤沉淀 加入蒸馏水20-50uL溶解质粒，取5uL做酶切实验 （液体尽量倒净并晾干） 离心12000 rpm，2min 质粒DNA的提取 知识回顾Knowledge Review * * 在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高