免疫细胞功能的测定_上海交通大学医学院医学检验系.pptVIP

ELISA测定各类免疫球蛋白 方法 1. 包板：96孔板用浓度为10μg/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。常规洗板，封闭。 2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液100μl。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C°过夜。 3. 加酶标二抗：每孔加100μl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°过夜。 4. 显色：洗板，每孔加100μl底物（p－nitrophenyl phosphate）。 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。 B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。 应用实践 ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。 B细胞产生抗体能力的测定 CTL杀伤功能的测定 基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。 CTL杀伤功能的测定 1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。 CTL杀伤功能的测定 51Cr标记法原理 如在将靶细胞与CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后， 51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。 CTL杀伤功能的测定 技术方法 1. 从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。 2. 51Cr标记肿瘤细胞。 3. 96孔培养板每孔中加入淋巴细胞和靶细胞，效：靶比为50:1，25:1，12.5:1。另设最大释放对照（靶细胞加去污剂）和自发释放对照（不加CTL）。 4. 37C°，5％CO2，4h。 5. 收集上清，?计数器测定放射活性（cpm）。 CTL杀伤功能的测定 计算公式 试验组平均CPM值－自发释放组平均cpm值 ％溶解＝ 最大释放平均cpm值－自发释放平均cpm值 注意点 由于CTL杀伤靶细胞受MHC限制，所以靶细胞必须来自自身，或选用表达适当MHC的肿瘤细胞系。 评价 优点：方法简单、快速，能定量。 缺点：自然释放率较高，需要的靶细胞量多。使用放射性核素。 CTL杀伤功能的测定 应用实践 这一方法常用于评估肿瘤患者CTL杀伤肿瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指标之一。 NK细胞毒性测定 基础理论 NK细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是CD16（Fc?RIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并分泌IFN－?和TNF。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和proteoglycans，引起靶细胞溶胀性死亡和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3结合，可介导ADCC作用。 NK细胞表达一种能识别HLA－A、－B、－C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达HLA I类分子时，抑制解除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。 K562细胞系不表达HLA分子，对NK细胞杀伤作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。 NK细胞毒性测定 技术方法 1. NK细胞的分离：用抗CD3、CD19、CD14单抗和淘洗法，去除T细胞、B细胞和Mo，获取NK细胞。 2. 加板： 方法同CTL杀伤试验。不同的是，靶细胞为K562细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自发释放对照组中不加Nk细胞。37C°，5％CO2，4h。 3. 收集上清液，?计数器测各孔cpm值。 4. 计算％溶解值：方法同C