实验1Folin-酚试剂法测蛋白质含量教学讲义.pptVIP

Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量 Determination of protein content by Lowry‘s method 怎样测定血清中蛋白质的含量 蛋白质含量测定的常用方法比较 选择测定方法时应考虑 1、实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 2、蛋白质的性质； 3、溶液中存在的干扰物质； 4、测定所花费的时间等。 实验目的 1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理 及其实验操作技术。 2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线 求样品溶液中待测定物质含量的方法 。 原理 1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。 原理 第一步：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。 即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。 原理 第二步：Folin-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。 即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。 即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 原理 样品 健康人血清 正常人血清蛋白质含量：60~80g/L 试剂 1、牛血清白蛋白标准液（200μg/ml） 2、碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3、Folin-酚试剂 仪器和器材 1、V-1100分光光度计 2、恒温水浴箱 3、试管6支、试管架 4、加样枪、加样枪架 5、坐标纸 操作 各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。 蛋白质浓度（μg/ml） 0 40 80 120 160 未知 注意事项 Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。 故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。 注意事项 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。 蛋白样品 碱性铜试剂 混匀， 放10min 加酚试剂 2s混匀 水浴10min 放至室温 比色 数据处理 2 3 4 5 测定次数 1 2 3 6 各管平均A值 各 管 A 值 绘制标准曲线步骤 1、选择合适的坐标纸 2、画坐标轴 3、根据测得的数据描点 4、连线 5、求实验结果 绘制标准曲线 以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。 吸光度A 蛋白质浓度C（μg/ml） 0.2 0.4 0.6 . . . . 40 80 120 160 绘制标准曲线 根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。 * * 1、Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测法方法，最低灵敏度为5μg，通常测定范围20~250μg。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干干扰物质较多。 2、考马斯亮蓝法是灵敏度最高的一种方法，优点有：灵敏度高，比L