基因工程课件4——实验3：聚合酶链式反应技术.pptVIP

实验三 聚合酶链式反应技术 （PCR技术） 实验目的与要求 掌握PCR反应原理 学习引物序列的设计 学习PCR反应体系的设计 学习PCR反应程序参数的设计 学习通过聚合酶链式反应(PCR)在体外大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。 Contents 一、实验原理 1、聚合酶链式反应技术简介 2、基本原理及特点 3、一个典型PCR的反应体系及程序参数介绍 4、DNA聚合酶 5、寡核苷酸引物的设计 1、聚合酶链式反应技术简介 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是1983年，美国科学家K. B. Mullis发明的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 PCR技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基因检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 2、PCR技术基本原理及特点 PCR技术实际上是在模板DNA， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。 反应主要涉及三个反应的循环： ①高温变性（denaturation），发生链的分离； ②低温退火（annealing），发生引物杂交； ③适温延伸（extension），发生DNA合成。 PCR反应循环示意图 3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍 反应体系： 反应物 终浓度 10×buffer 2μl 4×dNTPs(1mM) 800μmol/L MgCl2(25mM) 1.5mmol/L DNA聚合酶 1U 上游引物 P1 400pmol/L 下游引物 P2 400pmol/L 模板ＤＮＡ (20ng) 补水至总体积 20μl 3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍 （1）PCR缓冲液 含50mmol/L KCl及Tris-HCl（pH 8.3） （2）MgCl2 二价阳离子对于酶活性是必须的，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无效。Mg2+的最佳浓度相当低（一般1.5mmol/L ），且模板DNA中的EDTA及dNTPs中的负电离子基团——磷酸根等都会影响到Mg2+的有效浓度。 在开始新的PCR组合时，可在0.05mmol/L~5mmol/L之间，设0.5mmol/L的梯度，进行PCR，来摸索最佳Mg2+浓度。 Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （3）dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸） 每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L，一般在饱和浓度下使用，即每种200μmol/L。 （4）模板DNA 闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA。 对哺乳动物基因组DNA扩增，每次反应约需1~0.1μg，对于细菌或质粒DNA，仅为pg（10-12g）到ng（10-9g），还可以直接以细胞为模板。 4、DNA聚合酶 （1）Taq酶 TaqDNA聚合酶是于1986年从一种生活在75℃热泉中的栖热水生菌中分离纯化出来，具有3个重要的特性： 耐高温 最适温度是72℃，连续保温30min，仍具有相当的活性，且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力。 具有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性 使扩增的DNA的3’端多带上一个“A”，有利于进行TA克隆。 在体外，失去3’—5’方向外切酶校正活性，有参错情况出现。 在一次典型的PCR反应中，其参错率约为1/2*104核苷酸，在体内是1/109核苷酸。 （2）高保真酶 但没有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性，引物需要设计限制性酶切位点，以便后续的克隆。 （3）酶量控制 根据片段长短，循环数多少。并非越多越好，加酶过多，会导致非靶序列扩增。在其他参数最佳时，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNa酶。酶浓度太高，会出现非特异性扩增，而过低时，则扩增产量太低。 5、寡核苷酸引物的设计 引物设计关键点 与模板的互补及错配情况：应有效结合到目的序列上，尽可能不与其他部位结合。且两引物的结合位点之间一般为1~2kb，超过3kb扩增效率大大降低。3’端要求完全互补，尤其3‘端最后5~6个核苷酸的错配应尽可能的少。一般5’端可以