基因扩增检验技术.ppt

基因扩增检验技术基础与临床 什么是PCR Polymerase Chain reaction 聚合酶链式反应 概述 PCR含义： 聚合酶链式反应是模拟体内DNA复制过程，在引物介导下，通过高温变性、低温退火、中温延伸三个阶段，使特异的DNA片段数量呈指数倍增的过程。 反应原理： 变性 复性 25~40次 使目的DNA片段拷贝数放大 延伸 106~108倍 PCR反应的特点 灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量 PCR扩增产物的分析方法 1、凝胶电泳分析法 2、点杂交法 3、PCR-ELISA（微孔板杂交法）法 4、荧光探针定量PCR法 荧光定量PCR 概 述 定量PCR技术:是指以外参或内参为标准，通过PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。 荧光PCR特点 灵敏度高 特异性强 全封闭PCR过程，无需后处理 采用dUTP—UNG酶的防污染系统，有效降低污染机会 即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量 定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品 仪器自动分析，更快获得结果 定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别 定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为荧光探针和荧光染料。　1）TaqMan荧光探针：特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶将探针降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 荧光定量PCR的临床应用 荧光定量PCR的临床应用 感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定 常见病原体感染诊断 乙型肝炎 乙型肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病。全世界仅乙型肝炎病毒携带者就达3亿人。非洲、东南亚国家及我国是乙型肝炎高发区；HBsAg携带率10～15%。急性乙型肝炎患者的10～20%可转为慢性，其中一部分可发展为肝硬化或肝癌。 标本收集：抽以静脉血送检。注意操作中乙肝病毒的人为污染。 PCR检测方法： PCR技术直接检测病毒基因，可敏感地检测到1fg的HBA DNA。特别适合于病毒滴度较低的临床标本的检测，也是ELISA检测方法外的一种补充。 HBV DNA临床意义： HBV DNA具有传染性，是HBV感染及病毒复制的标志。可用分子杂交及PCR方法检测到HBV DNA。分子杂交可检出1pg/ml或105 拷贝/亳升，PCR法可检出1fg/ml或102拷贝/毫升的HBV DNA。 HBV DNA检测常应用于： a、HBV复制水平及传染性的评价； b、抗病毒治疗后，判定疗效及是否有复发； c、输血或母婴传播乙型肝炎的鉴定； d、肝移植中，评估和随访移植肝的HBV再感染情况。 淋球菌（NGH）感染 【临床意义】 ①PCR诊断技术是一种非培养的诊断技术。它是以分析淋球菌遗传物质，而达到特异、敏感、快速的检测，适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。 ②女性：对疑似淋菌引起的阴道炎、宫颈炎、附件炎、输卵管炎、子宫内膜炎等诊断和鉴别诊断有决定性作用。 ③男性：用于疑似淋菌引起的尿道炎、前列腺炎、精囊炎、附睾炎的诊断和鉴别诊断有重要意义。 沙眼衣原体（CT）感染 【致病机理】 衣原体侵入机体后主要在粘膜上皮细胞内繁殖，且抑制宿主细胞代谢。衣原体感染后机体免疫反应不强，且维持时间短，故往往可反复感染。 【临床意义】 PCR可对沙眼衣原体生殖泌尿道感染进行早期诊断，尤其适于对无症状携带者或轻症状患者的诊断；可作为衣原体感染的分子流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。 解脲支原体（UU）感染 【传播途径】 引起泌尿生殖系统的感染，主要经性接触感染。 【临床意义】 临床上对T株支原体（又称脲原体）的检测，过去主要靠免疫荧光抗体和培养。方法较繁琐，需要1～3天，才能得到实验结果。PCR技术用于UU感染的早期诊断，围产期筛