高级生物化学蛋白质.ppt

聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS原理：该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的 。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量 。 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷不同和分子筛效应进行分离。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者更佳。 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳 浓缩效应： 聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图 1. 某蛋白质溶液分别用SDS和阳离子交换柱层析进行分析，得到如图所示的结果。关于该溶液中蛋白质的组成，你的结论是什么？ 思 考 题 阳离子交换柱层析进行分析 SDS. 比较说明SDS(SDS-聚丙烯酰胺电泳)和琼脂糖凝胶电泳的物质 浙江大学2004 2、等电聚焦电泳： 在电泳支持介质中加入载体两性电解质通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。 当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不再为0，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”。保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。 等电聚焦电泳： 2D electrophoresis 1st dimension Separation based on pI isoelectric focusing 2nd dimension Normal SDS、离子交换层析法 离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。 离子交换层析法 离子交换基质 阳离子交换剂适合分离PI7的蛋白质(先用pH值低于7的缓冲液处理) 阴离子交换剂适合分离PI7的蛋白质(先用pH值高于7的缓冲液处理) (2)洗脱方法 在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。 一种是增加离子强度的梯度溶液。 二、改变pH值的梯度溶液，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减。 1. 某些蛋白质的等电点（pI）为5.0，在pH6.0的条件下能否采用CM-纤维柱层析(阳离子)来纯化该蛋白质,试说明理由。 厦门大学2004年生物化学考研真题 2. SDS测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同（判断）。 苏州大学2004 3. SDS是根据蛋白质分子极性大小来对它们进行分离的一种电泳技术（判断）. 中国科学院微生物研究所 4. 12. 下列有关核酸电泳和SDS电泳说法错误的是?????? A. 核酸电泳和SDS电泳中DNA和蛋白均向正极泳动； B. SDS不连续垂直电泳中，上层是分离胶，下层是浓缩胶； C. RNA分离需要变性条件下的琼脂糖凝胶电泳； D. 核酸电泳中溴化乙啶结合DNA的碱基对，在紫外下显色 中国计量学院2008年 思考题 1 、极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳等 具有吸附能力 2、吸咐层析法是：利用物质与不同蛋白质的吸附 能力的强弱不同达到分离目的。 3、蛋白质提纯中，最广泛和最有效的是结晶磷 酸钙即羟基磷灰石。 （四） 蛋白质的选择吸附分离 羟基磷灰石 疏水作用层析 疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理 根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依