Realtime PCR检测原理和问题处理.pptVIP

荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点 1) 全封闭反应，无需PCR后处理 2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理 定量PCR常见问题处理 扩增曲线-Amplification Plot 标准曲线-Standard Curve 原始数据-Component 各波长的原始信号-Spectra 融解曲线-Dissociation 定量PCR实验中的10个常见缺陷 1.引物或探针的设计不过关 2.RNA模板质量差 3.没有使用“预混液”，导致差异的累积 4.发生污染 5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰 6.选取了不恰当的“内参基因” 7.在使用SYBR Green染料的实验中，没有引入“融解曲线分析” 8.没有正确设置“基线”和“阈值线” 9.反应体系“扩增效率”低下 10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化 导致异常实验数据的常见原因 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 荧光污染 反应试剂质量问题 仪器硬件问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 实例1：没有标准曲线 标准品没有填写相应的数