载体的选择与构建.pptxVIP

第四章 载体的选择与构建主要内容1.细菌质粒载体2.噬菌体载体3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体★基因工程载体： 携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具。★载体的一般特性：在宿主中能自我复制或借助宿主染色体进行复制容易从宿主细胞中分离纯化具有容纳外源DNA分子的能力有限制性内切酶位点，便于基因组装有对载体进行筛选的标记或报告基因★1. 质粒载体★1.1 质粒的定义质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位，由J.莱德伯格在1952年提出。共生生物、真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。 ★1.2 质粒的分类1.2.1 按照复制性质： 严紧型质粒:带有与分配有关的基因，由DNA聚合酶Ⅲ复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，1～2个/细胞； 松弛型质粒:由DNA聚合酶Ⅰ复制，当染色体复制停止后仍然能继续复制，数十～数百个/细胞一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。1.2.2 按照构型： 环形双链DNA分子 共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型 开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口 线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是线性构型，开环构型最慢。 线性质粒 发卡线性质粒：在两端均有反向重复序列，形成共价闭合的发卡环 多肽结合质粒：5’端与多肽连接，同时两末端还具有反向重复序列，多为放线菌质粒这些结构可以防止质粒被降解1.2.3 按照接合能力: 接合型质粒（F质粒） 非接合型质粒 1.2.4 按照宿主范围: 广宿主质粒（以及穿梭质粒） 单一宿主质粒 1.2.5 按照宿主中的存在形式: 游离型质粒 整合型质粒（复制子不能被宿主识别，带有同源片段） 1.2.6 按照功能： 基因克隆质粒（筛选系统，MCS） 基因表达质粒(筛选系统，MCS，启动子，RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶） ★1.3 质粒的复制1.3.1 复制子(replicon)包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗传单元 质粒一般只带有少量复制需要的基因，其它由宿主提供。 广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因，而且启动子、RBS位点都可以被多种宿主识别。 质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列，可以用其它序列替换来进行基因克隆或表达。pMB1, colE1 replicon拷贝数15～20宿主范围小：肠细菌修饰的pMB1 replicon拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列)pSC101 replicon拷贝数5宿主范围广 多种革兰氏阴性菌pUB110 50广 多种革兰氏阳性菌pE194 5广 多种革兰氏阳性菌colE1 replicon1.3.2 拷贝数控制机理反义RNA对拷贝数的调控RNAII被RNaseH切割后充当复制引物链（前导链的引物），而RNAI与其结合后阻止RNaseH的切割质粒编码的Rop蛋白二聚体可提高两种RNA结合复合物的稳定性质粒拷贝数越高， Rop、 RNAI浓度越大，最终终止复制细胞分裂后，Rop及RNAI浓度变小，开始进行复制RepA 调控pSC101 repliconIterons are directly repeated sequences（17～22bp) which play an important role in regulation of plasmid copy number in bacterial cells （重复子）Ori附近的repA基因编码RepA蛋白，其对自身的表达具有负调节作用RepA蛋白可以和Iterons结合，促进复制复合物的形成，从而开始质粒的复制质粒拷贝数高时， RepA蛋白浓度高，形成二聚体，两个质粒聚集连在一起，复制停止。细胞分裂后重新复制★1.4 质粒的不稳定性 分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体； 结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失 质粒的分配方式：主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配