三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析.docVIP

第21卷3期中国病毒学21(3:261-266 收稿日期:2005-11-15, 修回日期:2005-12-21 * 基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻0235001-4;广西留学基金项目(桂科回0236005;广西水产畜牧局科研计划资助。 ** 通讯作者:谢芝勋(1963- ,男,汉族,广西博白籍,研究员,主要从事畜禽传染病及其分子生物学技术研究。 Corresponding author. Tel: 0771-*******, E-mail:xiezhixun@126.com。 262 中国病毒学第21卷 因组长度约为15kb,包含6个基因:3’-np-p-m-f-hn -l-5’,分别编码6个主要蛋白质(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白[3],目前,GenBank 上已发表的NDV全基因组序列共有两种长度:其中ZJ1(AF431744、U.S/Largo/ 71(AY562 900、Italy/2736/00(AY562989等7个毒株的全基因组序列长度为15192bp;其它毒株如B1、LaSota、Clone-30等为15186bp。近年来,随着NDV毒株B1、LaSota、Clone-30、Beaudette C 以及ZJ1等全基因组序列先后被测定,使人们在分子生物学领域对NDV的研究取得了较大的进展,为运用反向遗传技术研究NDV分子生物学特性提供了依据,也为基因疫苗的研制奠定了基础。 本实验室于2002、2003年分别从广西不同地区的大型规模化养鸡场分离到3株NDV野毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03,经致病性测定以及对f基因的克隆测序,证明为强毒株[4,5]。通过对f基因和hn基因的序列分析,发现其抗原位点发生了一定的改变[5,6]。为了进一步研究这3株新城疫病毒的生物学特性,从分子水平上揭示其生物学背景,我们以GenBank上发表的NDV全基因组序列为依据,以ZJ1等毒株为主要参考,设计了8对引物,采用RT-PCR方法扩增出其完整基因,并将所得的全基因组序列与GenBank上发表的全基因组序列进行了比较和分析,现将结果报告如下: 1 材料和方法 1.1 病毒 实验所用毒株GX7/02、GX9/03和GX11/03由笔者所在实验室分离鉴定和保存。通过MDT、ICPI、ELD50实验以及f基因和hn基因的克隆、测序及分析证明为强毒株[4~6]。 1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒、PMD18-T载体、凝胶回收试剂盒,购自Takara公司;LB培养基、Trizol抽提试剂,购自Invotrizen公司;氨苄青霉素、χ-gal、IPTG,为Promaga公司产品。 1.3 病毒RNA的提取 按Xie等[7]方法,取感染鸡胚尿囊液用Trizol 抽提试剂进行RNA的抽提。 1.4 NDV 各基因组的扩增及克隆 1.4.1 引物的设计与合成:参考GenBank已公布的NDV全基因组序列,以鹅源新城疫病毒ZJ1(AF431744毒株的核苷酸序列为主要参考,共设计了8对引物,相邻扩增片段之间,有部分核酸序列重叠,引物覆盖整个NDV基因组,由大连宝生物工程有限公司合成,引物序列在表1中列出。 表1 引物核苷酸序列 Table 1 The nucleotide sequences of the primers used in this study Prime r Sequence Position Gene Length (bp 1 2 ACCAAACAGAGAA TC GACAGTCCCACTGGTCTC 1-16 1932-1949 np1-1792 3 4 ACCCACCCGGGACAACACAGG CGGGCTGTACTTTGA TTCTG 1736-1758 3316-3335 p 1764- 3452 5 6 AAGCTAGA TGCA TCCAGGTCA TTGACGGCAGGCCTCTTGCAGCTG 3016-3035 4644-4665 m3056- 4716 7 8 CCA TCTCGACTGCTTA TAGTTAGTT AACAGAGTCGTGCTGGAGAA 4452-4477 6433-6452 f 4439- 6546 9 10 GACCTTGCTA TGGCTTGGGAA GCAGAGCACCAGA TCA TCCT ACCAGG 6150-6172 8441-8435 hn6208- 8453 11 12 13 14 15 16 ACGGGTAGGACA TGGCGAGC GCAAGTTGGA TTGCAGCAA T GACA TA TA TA TTGTCAGTGC TTGTCA TACACTA TTA TGGC GTGGTTTCTTA TGA TGAAGA C