微生物菌种的分离筛选.pptVIP

6.试管厌气培养法 7.Hungate滚管技术 利用除氧铜柱制备高纯度氮气（玻璃柱内装有密集铜丝，加温到350℃时，可使通过柱体的不纯氮气中的氧气与铜反应而被除去），驱除培养基配置、分装等过程各种容器和小环境中的空气，使各种操作始终处于高度无氧状态下。用严格厌氧方法配制的厌氧菌培养基称为预还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基）。进行严格厌氧菌分离时，先利用这种“无氧操作”把菌液稀释，并用注射器接种到装有融化后的PRAS培养基试管中，该试管用密封性极好的丁基橡胶塞严密塞住后平放，置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管内表面上，经培养后，会长出单菌落。 8.其他简便方法 （1）玻璃板隔绝空气法 （2）生物吸氧法 （三）微生物分离举例 1 红螺菌属（Rhodospirillum）分离（此类菌生长于水和淤泥中，厌氧或微嗜氧，属光能有机营养型（光能异养），利用光能合成有机物） （1）富集培养 培养基：NH4Cl 1g，K2HPO4 0.5g，MgCl2 0.2g，NaCl 2g，酵母膏 0.1g，蒸馏水1000ml。灭菌后加入10%过滤除菌的NaHCO3，2ml乙醇或50ml4%丙酸，用0.1N磷酸调pH至7.0。 取暴露于阳光下富含有机质的淤泥适量于50ml带玻璃塞的磨口瓶中，加满液体培养基，塞好塞子，置30℃照明箱中培养，3天内可见深处培养基和淤泥中曝光的一侧呈现微红色的生长物。从微红色处取数毫升富集培养物，接种于第二瓶的富集培养基中，培养2天。 （2）分离培养 A、培养基：富集培养基中加入酵母膏0.2%，琼脂2%，碳酸氢钠改为2g。另取Na2S·9H2O 1g，加水10ml，灭菌，在调pH前加入到分离培养基中，灭菌后制成平板或柱状培养基。 B、接种：取富集培养物在分离平板上划线或涂布，或用摇管法于柱状培养基中分离。前一种方法，可用焦性没食子酸和碳酸钠制造厌氧条件，或于缺氧条件下培养。挑选特征性细菌菌落，穿刺接种，塞紧管口，封蜡、培养后，待用。 2.反硝化细菌分离培养 反硝化细菌：G-，无芽孢的杆菌，厌氧或兼性厌氧，无氧条件下，还原硝酸盐或亚硝酸盐（作为最终氢受体），氧化有机物（属于化能异养类型的厌氧菌）。 （1）富集培养：培养基：KNO3 2g，柠檬酸钠 5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，水1000ml，pH7.2。在富集培养液试管中分别加少量海泥或池泥、河泥，20℃或25-30℃培养5-15天，若培养液浑浊，有气泡产生，说明可能有反硝化细菌生长；检验氨气和亚硝酸的产生，可准确判定。 （2）分离培养 培养基：葡萄糖1g，酒石酸钾钠10g，KNO3 2g，K2HPO4 0.2g，CaCl2·2H2O 0.5g，水1000ml，pH 7.4-7.6。 接种与结果观察：将上述培养液倾入硅酸胶平板，50℃烘烤到表面无水流动。富集物涂布平板，适温、厌氧培养到菌落足够大。观察菌落形态，做革兰氏染色，镜检菌体形态。挑取菌落于液体培养基培养，检验硝酸盐（用二苯胺试剂）和亚硝酸盐（用锌-碘-淀粉或格里斯试剂）。如果硝酸盐或亚硝酸盐消失，可确定所分离的细菌为反硝化细菌。 3.乳酸菌的分离筛选 （1）保加利亚乳杆菌的分离筛选 A、富集培养：培养基为（%）蛋白胨1，牛肉膏1，酵母膏0.5，葡萄糖2，土温80 0.1，磷酸氢二钾0.2，乙酸钠0.5，柠檬酸二胺0.2，硫酸镁0.005，pH6.2-6.6。进行富集培养。 B、分离纯化：富集物稀释，涂布平板（加琼脂2%），厌氧40℃培养2天，镜检。单菌落挑到5ml液体试管， 40℃静止培养2天。 C、菌种筛选：取发酵液放入150ml三角瓶，加水10ml，酚酞指示剂2滴，用0.1N氢氧化钠滴定到微红色，选出高产菌株。 D、菌种保藏：穿刺接种保存。或离心收集菌体，悬浮于pH4.2乳酸缓冲液中，制成高浓度菌悬液，取10ml装入0.2mm厚的聚乙烯膜袋内，封口，5℃可保藏180天。 （2）嗜热链球菌分离筛选 A、富集培养：酵母膏0.5%，胰蛋白胨1.5%，L-胱氨酸0.02%，硫酸钠0.01%，氯化钠0.1%，磷酸氢二钠0.2%，碳酸氢钠0.2%，蔗糖5%，pH7.3。40℃富集培养2天。 B、分离纯化：富集液稀释，涂布平板（加入2%琼脂），厌氧40℃培养2天，镜检。单菌落挑到5ml液体试管， 40℃静止培养2天。 C、菌种保藏：同上。 四、性能测定（初筛、复筛） (一)初筛：提高筛选效率，减少工作量；但是产物活性只能相对比较，难以确切得到产量水平，可以淘汰85%-90%不符合要求的微生物。 1.平板筛选：最好事先与摇瓶方法做一些对比实验，比较两种方法的差距，看其一致性。 如分离生物表面活性剂产生菌时，把加入羊血的培养基制成平板，将