拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25调控植物生长素响应的.pdf

中国农业科学 2014,47(17):3501-3512 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.17.018 拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25 调控植物生长素响应的功能分析 1,2,3 2 2 2 2 2 1,3 郭萌萌 ，陈 明 ，刘荣榜 ，马有志 ，李连成 ，徐兆师 ，张小红 1 2 （西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100； 中国农业科学院作物科学研究所/基因资源与基因改良国家 3 重大科学工程/农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室，北京100081； 西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室， 陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】鉴定生长素胁迫条件下纯合突变体 vps25 的表型，获得拟南芥液泡分选蛋白 AtVPS25 的互作 蛋白，并分析AtVPS25 和其互作蛋白在生长素响应过程中的功能及其分子机制。【方法】根据“三引物法”鉴定 突变体；通过观察拟南芥vps25 突变体在外加生长素的培养基上的表型，鉴定AtVPS25 的功能；以AtVPS25 为诱 饵蛋白，采用泛素分离系统筛选在拟南芥中与其互作的蛋白；利用酵母互作试验和双分子荧光互补试验（BiFC ） 验证AtVPS25 与AtAIR12 （for Auxin-Induced in Root cultures）的互作关系；鉴定AtVPS25 和AtAIR12 蛋白 在植物细胞中的定位情况；采用Real-time PCR 方法，分析在生长素处理条件下，部分生长素运输相关基因在拟 南芥vps25 突变体中的表达变化。【结果】Real-time PCR 结果显示，10 μmol·L-1 IAA 处理条件下，在野生型拟 南芥（WT ）中，AtVPS25 的表达量随着胁迫时间的增长而增高，并在12 h 达到最高，约为0 h 的40 倍，证明AtVPS25 受生长素处理的诱导表达。利用泛素分离系统筛库获得AtVPS25 的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25 与AtAIR12 全长蛋 白序列的酵母双杂交试验证明AtVPS25 与AtAIR12 互作。亚细胞定位试验证明AtVPS25 定位在细胞膜和细胞质中， AtAIR12 定位在细胞膜及叶绿体膜上。BiFC （双分子荧光互补）试验结果显示，AtVPS25 蛋白与AtAIR12 蛋白互作， -1 并且互作位点在细胞膜和细胞质中。突变体鉴定获得纯合突变体vps25。vps25 在 0.1 mg·L IAA 条件下生长， 表现为主根伸长受到抑制，并且相对同一条件下的 WT 的主根长度差异极显著（P ＜0.01 ），而同时侧根数无 明显差异，这与已报道的 air12-1 突变体在生长素处理条件下的表型相似。10 μmol·L-1 IAA 处理时，在 WT 背景条件下，AtAIR12 的表达量对IAA 响应明显，并且随着胁迫时间的增长而增高，在 12 h 时达到最高，约 为 0 h 的80 倍，证明 10 μmol·L-1 IAA 处理条件下，WT 中AtAIR12 表达量的变化趋势与 AtVPS25 完全相同。 同时在vps25 突变体背景条件下，AtAIR12 的表达相对于WT 受到抑制，在 0-24 h 表达量无明显变化。此外， 在 vps25 突变体背景条件下，生长素输出载体基因 AtPIN2 相对于 WT 中表达量