第一讲 分光光度技术.pptVIP

检测器：把光信号转换为电信号的装置。 对检测器的要求： 产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系； 波长响应范围大； 灵敏度高； 响应速度快，一般要求小于10-8s； 产生的电信号易于检测、放大，噪声低。 几种常用检测器比较 检测器 工 作 原 理 特 点 光电管 外光电效应 简单,灵敏度低 光电倍增管 外光电效应与多级二次发射体相结合 灵敏度比光电管高200多倍 光电二极管阵列 外光电效应，由一行光敏区和二行读出寄存器构成 可同时检测多个波长的光强度。寿命长、光谱响应范围宽、可靠性高、读出速度快 光电池 内光电效应 结实、便宜、使用方便。但产生的电流大小不稳定 电荷耦合器件 模拟集成电路芯片 能同时多谱线检测，极大地提高分析速度 7 分光光度技术的应用 A 测定溶液中物质的含量 比色法：测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度待测定的溶液)的吸光度，将两者进行比较。 Ax/As=KCxL/KCsL，即： Cx=Ax×Cs/As 式中Cx代表未知液的浓度，Cs代表标准液的浓度，Ax和As分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式计算得之。 分光度法： 先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线。 测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，原因： ①灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异； ②可以避免其他物质的干扰。 ? B 用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。 方法：用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度。以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度—波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。 各种物质有其特定的吸收光谱曲线 通过比较未知物质与已知物质的吸收光谱曲线形状（吸收高峰和低谷的波长）来确定 紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。 紫外光吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。 除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。 紫外光吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。 使用分光光度计注意事项 仪器须安放在稳固的工作台上，不能随意搬动。严防震动，潮湿和强光直射。 盛装比色液时，约达比色皿2/3体积，不宜过多或过少。若不慎使溶液流至比色皿外面须用棉花或拭镜纸擦干，才能放入比色架。拉比色杆时要轻，以防溶液溅出，腐蚀机械。 千万不可用手或滤纸等物摩擦比色皿的透光面。 比色皿用后应立即用自来水冲洗干净，若不能洗净，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鲜配制的重铬酸钾洗液短时间浸泡，然后用水冲洗干净，倒置晾干。 每套分光光度计上的比色皿和比色皿架不得随意更换。 试管或试剂不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。 如果试剂溅在仪器上，应立即用棉花或纱布擦干。 测定溶液浓度的光密度值宜在0.1—0.8之间最符合光吸收定律，线性好，读数误差较小。如光密度超过0.1—1.0范围，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，再进行比色。 合上检测室盖连续工作的时间不宜过长，以防光电管疲乏。每次读完比色架内的一组读数后，立即打开检测室盖。 仪器连续使用不应超过2小时，必要时间歇半小时再用。 测定未知液时，先作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定波长。 仪器较长时间不使用，应定期通电、预热。 仪器用完之后，须拔去电源，套上仪器罩。 紫外-可见分光光度计常见故障及排除方法 分光光度计常见故障包括光路、电路故障。 根据故障不同应采取不同的排除措施。 接通电源后，指示灯不亮，仪器不工作，可能是电路故障； 读数表不能调零（即0％T）和不能置100％T则可能是光路故障或微电流放大器损坏。 * * * 高级生化与分子生物学技术 食品与生物工程学院 生物工程教研室 主讲人：李爱贞 杜翠红 azli@jmu.edu.cn 第一讲 分光光度技术 1 概述 2 朗白比尔定律 3 显色反应 4 显色剂 5 测量误差及测量条件 6 紫外-可见分光光度计 7 分光光度技术的应用 非光谱法： 如折射法，浊度法，旋光法 不以光的波长为特征讯号，比较有色溶液颜色深浅。 光谱法： 光学分析法 1 概述 在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来来鉴别物质或测定其含量的技术。 分为：吸光光度法，发射光谱法 真空紫外光度法：10～200 nm（远紫外光）