细胞染色示踪方法.docVIP

DAPI 和 BrdU 等染料标记细胞都存在随细胞分裂荧光减弱的现象，荧光染料标记的方法， 有一个难以克服的问题： 细胞在受体内存活难以证明， 因为这些经过荧光染料标记的细胞被 巨噬细胞吞噬后， 细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达， 有时也会导致细胞周围的其他 细胞出现假阳性。所以，仅使用这样的标记方法是很难在国际杂志发表论文的。 比较可信的标记方法是 Y 染色体和转基因标记，最理想的办法是 GFP 基因转染。这些标记 的方法不仅可以显示细胞的存活情况， 还能够准确的显示细胞的定位。 同时由于是表达型的 标记方法， 所以不存在减弱的现象和丢失的现象， 也不存在假阳性的问题， 所以是一种准确 的细胞标记方法。 GFP 标记方法稳定，容易检测，结果权威，被国际上的科学家广泛认可 . 标记方法有： 1、遗传性地改变细胞的基因，表达标志物 （1）绿色荧光蛋白（ GFP ）或者红色荧光蛋白（ RFP ）报告基因的转染。 这是目前鉴定移植细胞最常用的方法。将携带有 GFP 或者 RFP 基因的质粒载体、逆转录 病毒载体或腺病毒载体转染待移植的细胞， 通过荧光检测受体组织中的 GFP 或者 RFP ，可 以对移植的细胞进行定性和定位观察。是目前最权威的一种标记方法之一。 （2） β半乳糖苷酶（ β-Gal 、LacZ ）基因转染细胞标记技术。 这也是目前鉴定移植细胞常用的方法。 2.选用雄性供体和雌性宿主，利用 Y 染色体作为标志物 染色体组成是雄杂合型 (XY 型)：雌性个体性染色体组成为 XX, 雄性个体性染色体组成为 XY。 移植后，通过检测雌性宿主不同组织中的 Y 染色体出现的情况，来判定外源性的细胞在宿 主体内的分布。 3.利用染料标记细胞 DAPI ：4,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是 4，6-联脒-2- 苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似：它们与 DNA 双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用， 从而与 DNA 的双链紧密结合。 结合后产生的荧 光基团的吸收峰是 358nm 而散射峰是 461nm ，正好 U（紫外光） 的激发波长正好是 356nm ， 使得 DAPI 成为了一种常用的荧光检测信号。 BrdU ：BrdU 和 DAPI 同属于 DNA 结合型荧光染料， BrdU 会随着细胞分裂而不断被 “稀释 ”， 以至于最终完全不能检出。因而不适合做长时期的体内标记追踪。 BrdU 标记法的基本原理 是利用溴化脱氧尿嘧啶 （BrdU ）作为胸苷类似物可以掺入到新增殖细胞合成 DNA 中的特点。 DiI ：1，1’二（十八烷基） -3，3，3，3- 四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐 （1,1-dioctadecy1-3,3,3 ， 3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI ）是一种亲脂性碳花青染料，容易嵌进生物 质膜内并在膜内做定向扩散运动从而标记整个细胞。 荧光染料 DiI 被认为以类似于磷脂的方 式与脂蛋白结合， 最初用于荧光显微镜下观察细胞结合或内吞脂蛋白， 并能进行半定量分析。 用有机溶剂提取细胞膜受体结合的 DiI 标记的脂蛋白或用 Na0H —SDS 裂解细胞后直接进行 荧光分析， 可以定量检测脂蛋白受体活性， 这一方法被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系 的研究。