中枢神经系统对大鼠咽肌前运动神经元的神经调控——假狂犬病毒跨突触标记.docVIP

???? 中枢神经系统对大鼠咽肌前运动神经元的?神经调控——假狂犬病毒跨突触标记 ???? ????　摘要　为了探讨中枢神经系统对咽肌前运动神经元的神经调控机制，用免疫组织化学方法研究了假狂犬病毒(PRV)注射咽肌后跨突触标记细胞在脑中的分布。咽肌注射PRV后，脑内PRV标记细胞出现的部位随着动物存活时间的延长而增多。咽肌注射PRV后48h，仅在疑核半致密部中出现阳性标记细胞。存活56h后，标记细胞可见于孤束核的中介亚核、中间亚核及吻内侧亚核。存活62～72h后，在延髓的中缝核群、三叉旁核、外侧网状核，脑桥的蓝班核、臂旁核、A5细胞群等部位可见大量标记细胞。存活80～96h后，延髓和脑桥中上述部位的标记细胞更为密集，并在三叉神经脊束核及Barrington核等出现标记细胞。中脑的中央灰质和中脑深核；丘脑下部的视前区、室旁核、外侧区、弓状核、连合前核；丘脑的室旁核和外侧缰核；端脑的外侧隔核、终纹床核、杏仁核等部位可见大量阳性细胞。存活102h的动物，标记细胞的分布部位和存活96h者类似，但数量更多。且在皮层的边缘前区、内侧和外侧中央前区等出现较多标记细胞。推测脑内许多部位与咽肌前运动神经元的神经调控有关。　　关键词　假狂犬病毒　咽　前运动神经元　免疫组织化学　大鼠 　　咽肌参与吞咽反射活动，但迄今对吞咽反射的中枢调节机制尚不十分明了。已知支配咽肌的运动神经元为疑核，延髓中某些能将咽肌的传入冲动中继到支配咽肌的运动神经元，引起并协调吞咽动作的中间神经元，称为咽肌前运动神经元(premotor neurons)。我们已证明咽肌的前运动神经元位于孤束核的中介亚核、中间亚核和吻内侧亚核及其周围的网状结构中［1，2］。但脑干和大脑中对孤束核中前运动神经进行调控的部位，由于方法的限制并不清楚。虽然用传统的束路追踪法对孤束核的传入及传出投射进行了一些研究［3］，但不能证明脑干和大脑中投射到孤束核的神经元中那些是和调控咽肌的运动有关。假狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)能沿特异的神经通路跨突触感染，并可用免疫组织化学显示PRV感染的第二级神经元。随着动物存活期的延长，还能显示第三级以上神经元［4］。我们在以往的研究工作中曾用PRV研究了咽肌的第二级神经元即前运动神经元在脑干中分布［1，2］，本研究在存活期较长的动物上观察了脑干及大脑中第三级以上PRV标记细胞的分布部位，以期探讨中枢神经系统对咽肌前运动神经元的调控机制。 材料和方法 　　实验用SD大鼠41只，体重310～480g，按不同的存活期分为8组(48h4只，56h4只，62h6只，66h4只，80h6只，96h6只，102h6只)。腹腔内注射Ketamine(85mg/kg)和Xylazine(12mg/kg)麻醉后，将动物固定在定位仪上，腹部向上，将口腔尽量张开，向前牵引舌根，暴露软腭，直至能清楚地看到悬雍垂为止。沿正中线切开软腭，暴露咽部。用Hamilton注射器将假狂犬病毒(Bartha株，Dr.L.W.Enquist赠送)2～4μl(浓度为5×108 plaque forming units/μl)分两点注射于咽肌中。用棉签轻轻擦干净注射部位，尽量避免污染其他器官。动物存活48～102h后，再次在麻醉下经心脏灌注取脑，即先灌注生理盐水100ml，再灌注PLP固定液500ml。将脑取出后放在含20%蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液中，在冰箱中过夜。冰冻连续冠状切片，片厚35μm。然后进行ABC免疫组织化学反应。抗假狂犬病毒血清为DP132(Dr.L.W Enquist赠送)，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG(Vector公司)，在ABC溶液(Vector公司)中进行反应后，用葡萄糖化酶和硫酸镍胺增强的DAB(GDN)法呈色。切片经脱水、透明、封片后在Leitz显微镜下观察、摄片。　　对照实验　(1)将假狂犬病毒注射于颈部食管中，其余实验设计及步骤同实验组；(2)将生理盐水注射于咽肌，其余实验步骤同实验组；(3)用兔血清代替抗假狂犬病毒血清进行免疫组织化学反应，其余实验步骤同实验组。 结　　果 　　用免疫组织化学GDN法染出的PRV免疫反应物质呈紫黑色，位于胞体及突起中，深浅不一。PRV免疫反应物质主要位于神经细胞中，在存活期较长的动物，有些胶质细胞中也可见PRV阳性反应。但胶质细胞比神经细胞要小得多，容易区分。　　将PRV注射于大鼠咽肌后，脑内PRV阳性标记细胞的分布部位随着存活期的延长而增多。咽肌注射PRV后48h，仅在疑核半致密部中出现阳性标记细胞。存活56h后，PRV跨突触感染的第二级神经元可见于孤束核的中介亚核、中间亚核和吻内侧亚核及其周围的网状结构中［1］。存活62～72h后，在延髓和脑桥的许多结构中出现标记细胞。存活80～96h后，延髓和