豆角中血细胞凝集素的分离提纯及分子量测定.doc

豆角中血细胞凝集素的分离提纯及分子量测定 PAGE PAGE 1 豆角中血细胞凝集素的分离提纯及分子量测定 参赛者资料： 南方医科大学第一临床医学院 06级临床医学五年制专业 常威 金花初 要 目的：分离提纯豆角中血细胞凝集素及测定分子量 方法：凝胶层析法，SDS电泳 关键词：豆角 血细胞凝集素 凝胶层析 SDS电泳 前言 近年来，豆角中毒事件屡次发生，受到了各界广泛的关注。据一些研究表明其毒性物质为豆角血细胞凝集素。它是广泛存在于各种植物中的抗营养因子，在高温中可被分解破坏，但在菜肴烹饪中如不注意火候温度，便容易使人误食未经高温灭活的血细胞凝集素而导致凝集素中毒。凝集素中毒潜伏期可长可短，一般在2-4小时。中毒者会出现恶心、呕吐、腹痛腹泻、头疼、头晕、心慌胸闷、出冷汗、手脚发冷、四肢麻木、畏寒等症状。 血细胞凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质,在细胞识别和粘着反应中起重要作用,主要是促进细胞间的粘着，因具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着。 2．实验目的 本实验通过对豆角中血细胞凝集素的粗提取，应用凝胶层析法对其分离提纯，并且应用SDS电泳测定其蛋白质相对分子量，来进一步研究豆角中血细胞凝集素的生物化学性质及意义。 实验原理 3．1 血细胞凝集素特性：血细胞凝集素是一种非免疫来源的、对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子，它是能够可逆地结合到特异单糖或多糖上的蛋白质，故可通过葡萄糖洗脱液洗脱分离。 3．2 凝胶是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，因其有立体的网状结构故有分子筛效应，利用凝胶层析可以脱盐，分离提纯蛋白质。 3．3 聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）2-CH2(缩写Bis)在催化剂过硫酸铵（NH4）2S2O8作用下形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺（TEMED）用来引发和控制聚合反应。反应混合物在底部用1.5%琼脂凝胶封闭，反应液顶部覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构,具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。 实验设备 名称 规格 数目 备注 恒温水浴箱 1台 自动部分收集器 1台 蠕动泵 1台 组织捣碎机 1台 普通离心机 3000r/m 1台 移液枪 10μL，100μL 各一 试管、烧杯 小号 各3个 SDS电泳仪 1台 染色/脱色皿 1个 滤纸 5块 层析柱 1.0*25cm 1个 笔记本电脑 1台 ★ 摇床 1台 ☆ ★为自备用品，无需主办方提供。 ☆为非必须器材，主办方没有则不必准备 实验材料及试剂 5．1试剂的配制 5．1．1 蒸馏水 500mL 5．1．2 Sephadex G50 (自备) 5．1．3 1M的氯化钠溶液 1000mL 5．1．4 含0.5M葡萄糖的1M的氯化钠溶液 500mL 5．1．5 下胶：（12%） 水9.9mL 30%丙烯酰胺溶液12.0mL 1.5mol/L Tris(pH8.8)7.5mL 10% SDS300μL 10%过硫酸氨300μL TEMED12μL 5．1．6 上胶：（6%） 水4.1mL 30%丙烯酰胺溶液1000μL 1.5mol/L Tris(pH6.8)750μL 10% SDS60μL 10%过硫酸氨60μL TEMED6μL 5．1．7 染色液：0.5g考马斯亮蓝R250，90mL甲醇，20mL冰乙酸，加水至200mL 5．1．8 脱色液：90mL甲醇，20mL冰乙酸，加水至200mL 5．1．9 10×电泳缓冲液（pH 8.3）：称取3.0g Tris base，14.4g Glycine，SDS 1.0g加双蒸水至100mL溶解。 5．1．10 2×样品缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2.0mL，甘油2.0mL，20%SDS(w/v)2.0mL