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西北大学学报(自然科学网络版) 2006年5月，第4卷，第3期 Science Journal of Northwest University Online May. 2006，Vol.4，No.3 DNA损伤检测新方法简述 屈 颖1，齐 浩2，罗明志2, 3，郭 伟2，刘 淼2 （1．西北大学 光子学与光电技术研究所，陕西 西安 710069；2．陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062； 3．西安文理学院 生物系，陕西 西安 710065） 摘 要：介绍了彗星实验的发展历史、彗星实验的检测原理，最后重点介绍了彗星实验流程，包括细胞的获得、制胶、裂解、电泳等几个方面。彗星实验作为一种简单、快捷、灵敏检测DNA微损伤的方法，已广泛应用于基因毒性检测的各领域。 关 键 词：彗星实验；基因毒性检测；原理；流程 中图分类号：Q2 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2006)0209-06 彗星实验（Comet assay），又称单细胞凝胶电泳SCGE（Single cell gel electrophoresis）是一种在单细胞水平检测DNA微损伤的方法。它是在载玻片上用少量琼脂糖凝胶包埋单个细胞，细胞经裂解、解旋和电泳后，断裂的DNA在电场力作用下向阳极移动，经荧光染料染色，在荧光显微镜下可观察彗星样图像——明亮的头部和弥散的彗尾，之后进行图形分析即可在单细胞水平判断DNA损伤程度[1]。 与传统检测方法相比（梯度沉降技术、解旋技术、洗脱技术等）[2]，彗星实验具有以下特点：① 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T和B淋巴细胞敏感[3]；② 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；③ 实验耗材皆为常规试剂；④ 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；⑤ 安全性好，避免了同位素的使用；⑥ 在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测；⑦ 准确性好、灵敏度高。彗星实验是检测DNA微损伤的新方法，且在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 1 彗星实验发展简史 1976年，Cook等人发明了一种研究DNA损伤的方法[4]。他们采用含非离子型去垢剂和高摩尔浓度NaCl的裂解液裂解细胞，使细胞膜破裂、细胞质和核质被抽提、染色体结构被破坏、大部分组蛋白被抽提，留下核骨架。结合在核骨架上的DNA形成DNA loops。当DNA损伤时，DNA loops向细胞核外扩散形成“halo”。通过测量Halo环的面积就可检测细胞DNA损伤程度。 1978年，文献[5]在此基础上第一次报道了在单细胞水平直接对DNA损伤进行定量检测。将含有靶细胞的琼脂糖铺在载玻片上，用含高浓度盐分和去垢剂的裂解液裂解细胞，之后在弱碱性条件下使DNA解螺旋，中和后使用吖啶橙染色，显微分光光度计测定绿色荧光强度与红色荧光强度，两者比值可定量反映DNA损伤程度。但较高的实验条件限制了该技术的广泛应用[6]。 在此基础上，文献[7]建立微凝胶电泳技术。该技术在解旋后加入电泳步骤使DNA断片在电场力的作用下从细胞核移出并向阳极移动，形成彗星样尾巴。DNA经溴乙啶染色后，在荧光显微镜下可观察、测_______________________ 收稿日期：2005-04-11 基金项目：西安文理学院校基金（KY200531）；陕西师范大校重点基金(995098)；西北大学科学研究基金项目资助（03NW07） 审 稿 人：田来科，男，西北大学物理系教授 定DNA移行距离。若细胞DNA损伤增加，断片移行距离也就增长。 中性彗星实验只能检测双链DNA断裂DSBs（Double strand breaks），所以，文献[8]建立碱性彗星实验（pH13.0），该实验能够检测单SSB（Single strand breaks）、双链的断裂和碱性不稳定点ALS（Alkali labile sites）[9]。此时，彗星实验检测的灵敏度得到极大提高，如具有基因毒性的大部分化学试剂诱导的DNA单链断裂和碱性不稳定点可得到检测。因此碱性彗星实验成为检测DNA微损伤的新方法。 1999年3月举行的国际遗传毒性检测程序工作会议（IWGTP）上确定了彗星实验的指导方针。由于碱性彗星实验能检测DNA单、双链断裂与碱性不稳定点、DNA交联(DNA cross-links)及不完全切除修复位点等多种DNA损伤，代表们认为碱性彗星实验是适用于检测各种物质的基因毒性，可见，碱性彗星实验得到认可。20世纪90年代以来，Singh与Olive两个实验室分别对影响彗星图像的各种因素及在实验操作中影响实验结果的处理过程进行研究，并在进一步提高该方法灵敏度方面做着探索[10]。 目前，有研究者将彗星实验和原位杂交相结合，建立荧光原位杂交彗星实验(Com