细胞生物学研究方式.pptVIP

* * * * * * * * ⑴一组滤光片：激发滤片和吸收滤片。⑵双色镜。 * * * * * * * * * 动画 * * * B. 抗体 + 胶体金 EM(免疫电镜) C. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体＋酶 酶 酶 底物 显色 四、细胞内特异核酸系列的定位与定性 ——原位杂交技术 细胞内特异核酸系列的定位与定性通常采用原位杂交技术(in situ hybridization).即用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。 原位杂交的基本过程： 用组织学常规方法制作的组织、细胞或染色体载片，经高温或高PH条件处理，细胞或染色体中的双链核酸分子变形成两条互补的单链，逐渐恢复溶液的温度或PH值，根据碱基配对原则，分开的两条单链会自动复性成原来的双链结构。通常先给其中一段顺序进行标记（同位素或荧光素），称其为“分子探针”，在荧光显微下直接显示与探针杂交的核酸存在的部位。 荧光原位杂交（FISH） 人类染色体端 粒DNA的荧光 原位杂交照片 放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银（AgBr，AgCl)乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。（核子乳胶：专用于放射自显影的乳胶。） 一般用14C和3H（氚）标记。常用3H-TdR来显示DNA，用3H-UdR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。 分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌 六、定量细胞化学分析技术 （一）显微分光光度测定技术 细胞显微分光光度测定技术（microspectrophotometry）是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定如核酸与蛋白质等在每一个细胞内含量。 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。 利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。 （二）流式细胞仪（flow cytometry） 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。 荧光活性细胞分拣 荧光活性细胞分拣传感器 荧光检测器 电极板 信号细胞分拣到测试管 其他分子生物学技术 印迹杂交方法 Southern杂交：DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA, 探针为DNA或RNA。 Northern杂交: RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA, 探针为DNA或RNA。 western杂交：抗原与抗体的结合-蛋白质间的杂交 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 （一）动物细胞培养 （二）植物细胞培养 二、细胞工程 （一）细胞融合与细胞杂交技术 （二）单克隆抗体技术 三、基因工程 实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 Henrietta Lacks BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （一）动物细胞培养 群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的