熔解曲线分析.ppt

This example shows the stability of the APO Assay as a total reaction mixture being stable for up to 48 hours and creating similar ct. This is very convincing for high throughput customers. 绝对定量 用于鉴定病原体或所研究基因的存在与否 用于检测病原体基因的拷贝数或浓度 绝对定量 未知样本的浓度由标准曲线得出 Cycles Fluorescence 标准品 Fluorescence Target 未知样品 Cycles Crossing Point Log Concentration 标准曲线 结果 绝对数值 (e.g. 拷贝数) 理论上目的基因表达量分析条件 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 相对定量的必要性 相对定量 原理：比较同一样品中不同基因的表达量 用于检测复杂实验处理中细微的基因表达的变化 用于长期实验及不同实验体系中所得数据的比较 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要） 相对定量分析几要素 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 相对定量分析——管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实验值 β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT P P P O 双标准曲线法 2 -△△Ct法 相对定量分析——两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析——双标准曲线法 公式： 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析——双标准曲线法 检测样品 管家基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 实验数据 相对定量 Step 1: 计算出同一样品中目的基因和参考基因的Cp值 Step 2: 最终结果用目的基因的浓度比上参考基因浓度 结果表达为目标基因浓度与参比基因浓度的比值 相对定量 参考基因 “看家”基因 Housekeeping genes: 编码有基础细胞功能的蛋白质 使用标准曲线的相对定量 使用校准品的相对定量 校准品 Calibrator 提供几次实验中的校准点，校正不同次实验间以及不同批号间的差异 校正目的基因和参考基因的检测灵敏度的区别，已经长期实验中的间次差别 校准品可以是： 没有处理的样品 在处理前时刻的样品 (at time 0) 正常的组织 荧光定量 PCR 的完整流程 荧光定量 PCR 的原理 检测方法 SYBR Green I, ResoLight, TaqMan Probes, HybProbes 分析 定性分析 判断目的基因是否存在 Tm 值 定量分析 绝对定量 Absolute Quantification 相对定量 Relative Quantification 罗氏荧光定量试剂介绍 总览 试剂特点 全新经特殊优化的通用参考颜料，适合于所有的需要校正的荧光定量PCR平台。 最长可扩增500bp的片断，适合多种DNA和cDNA靶序列的检测，包括GC-或AT-富含区域。 室温下依然稳定，可满足大量样本的qPCR反应自动化加样操作需要。 FastStart SYBR Green Master FastStart TaqMan P