沼泽红假单胞菌中类胡萝卜素的提取与分析 .docVIP

1.8mm ol ΠL Mg 2+ ,20ng 模板DNA ,ddH 2O 12.55μL 。 图3　引物s298对居群A8的扩增结果 1~10为居群A8的10个样品,M 为DNA M arker 。Fig.3　PCR am plified patterns by primer s298in 10sam ples from A81~10are the codes of sam ples ,M is DG L 2000DNA marker. 3　讨论 RAPD 分子标记技术基于PCR 反应,受反应条件和扩增程序变化以及物种不同的影响。本试验结果证明,采用不同的浓度组合对星星草的RAPD -PCR 扩增结果差异很大。 Mg 2+ 浓度是影响PCR 结果的重要变量之一。Taq DNA 聚合酶是Mg 2+依赖性酶,对Mg 2+浓度非常敏感。选择合适的Mg 2+ 浓度,对PCR 反应至关重要。引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响,特别是其中的Mg 2+浓度能影响反应的特异性和扩增片段的产率。在一般的PCR 反应中,1.5~2.0mm ol ΠL Mg 2+ 是比较合适的。本实验发现 1.8mm ol ΠL Mg 2+ 浓度是适合的。 底物dNTP 浓度过高,会导致聚合酶错误地掺入,浓度过低,又会影响合成效率,甚至会因dNTP 过早消耗而使产物单链化,影响扩增效果。在PCR 反应中,dNTP 浓度应在1.0~2.0mm ol ΠL 。本研究设置了1.2、1.4、1.6mm ol ΠL 三个浓度梯度,结果表明,在1.6mm ol ΠL 时,PCR 反应的稳定性最好。 Taq 酶的使用量也是影响实验的一个重要因素。使用高浓度的Taq 酶不仅成本过高,而且容易产生非特异性扩增产物;Taq 酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降。一般随机 扩增反应中,Taq 酶的用量在0.2~1U 之间。本实验设置了 0.25U 、0.3U 、0.35U 三个T aq 酶含量梯度。结果表明在20μl 的 反应体系中使用0.25~0.35U T aq 酶含量均有扩增产物出现,但0.3U 时扩增反应最佳。 与以往的单因素PCR 优化设计相比,利用正交试验直观分析的方法,能够迅速获得满意的试验结果。但该方法亦存在一定的局限性,如对实验结果本身优劣的判断依据带有主观上的成分,不能很好地估计试验误差,说明各个实验条件之间的互作等。如果能够对PCR 扩增条件及结果建立客观的评判标准,无疑将极大地促进PCR 技术的发展。 参考文献: [1]中国饲用植物志编辑委员会.中国饲用植物志(第一卷[M].北京:农业出版社,1978:165-168. [2]席嘉宾,杨中艺.中国地毯草野生种质资源调查[J ].草业学报, 2004,13(1:35-41. [3]J G W illiams ,A R K ubelik ,KJ Livak ,et al.DNA polym orphisms am plified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J ].N ucl .Acids .R es .,1990,18(2:6531-6535. [4]J W elsh and M M cClelland.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J ].N ucl .Acids .R es .,1990,18:7213-7218. [5]毛培胜,王颖.指纹图谱技术在紫花苜蓿品种鉴定中的发展与应用[J ].草业科学,2005,22(2:26-29. [6]Rima B.Franklin ,D ouglas R.,et al.Characterization of microbial communi 2ties using randomly am plified polym orphic DNA (RAPD [J ].Microbiol Meth 2ods ,1999,35(3:225-235. [7]P.R.L.M oreira and E.M orielle -Versute.G enetic variability in species of bats revealed by RAPD analysis[J ].G enetics and Molecular R esearch ,2006,5(4:804-815. [8]李景欣,云锦凤.内蒙古冰草种质资源遗传多样性研究[J ].草地学报,2005,13(4:352-353. [9]刘金文,沙伟,滕兆岩.采用正交设计和响应曲面设计法优化芦苇随机扩增多态DNA 体系[J ].广西科学,2004,1