RNA原位杂交，单分子检测.PDFVIP

RNA 原位杂交，单分子检测 ® QuantiGene ViewRNA Assay 在单细胞水平上实现灵敏的RNA单分子检测 使用多个探针获取每个靶标的特征信号 快速完成目标RNA的分析 扩展原位基因表达分析的应用范围 原位定量的发展，尤其是在蛋白质或RNA （mRNA或非编码RNA ）水平，有许多技术上的限制。例如，蛋白质表达定量结果受到抗体 有效性、质量和来源影响，这些因素直接造成分析的灵敏度和特异性不佳。相似情况，RNA表达也因为较低的灵敏度（如非放射性形式）、 冗长复杂的实验流程（如放射性形式）或者无法同时进行多重分析而应用范围有限。 ® QuantiGene ViewRNA是种新型原位杂交(in situ hybridization, ISH)技术，可在细胞中或组织切片中实现单拷贝级别灵敏度的RNA 定位和定量，可为所选的目标RNA设计探针组。针对细胞样本，可使用荧光法(FISH)同时检测最多四种RNA ，既可应用于较低通量的 研究型实验，也可应用于较高通量（兼容自动化）的筛选型实验。对于组织，即福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)或冷冻切片，可使用 Fast Red底物来检测单个靶标RNA ，该底物同时有显色性和荧光性，显色性(CISH)使其可通过标准的明场显微镜进行可视化观察，荧 光性则使其可通过荧光显微镜（550 Ex ，Cy3滤镜）进行可视化观察。 工作流程 QuantiGene ViewRNA基于专利的探针组设计和branched DNA (bDNA)信号放大技术。包含20个寡核苷酸对的靶标特异性探针组与 靶标RNA杂交。信号放大则以相邻探针组寡核苷酸对与靶标RNA的特异性杂交为基础，从而获得较低的背景、绝佳的特异性及较高的 信噪比。独立但兼容的信号放大系统实现了在单次分析中细胞内多达组四种RNA。 实验的工作流程包括四个主要步骤：样本制备、靶标与探针杂交、使用bDNA信号放大技术进行信号放大以及最终的显色反应（图1 ）。 版面有限，仅显示了一个RNA靶标，并仅显示了靶标RNA上20个寡核苷酸对中的两个。 图 1 ：QuantiGene ViewRNA 分析工作流程。 样本制备 靶标杂交 信号放大 检测 用于组织分析 靶标特异性 信号预放大探针 的Fast Red底物 探针组 或 信号放大探针 用于细胞分析 的荧光探针 孵育 或 标记探针 用于高通量检测 的冷光系统 序列特异性杂交 固定细胞 和透化 使用以下器材观察： ■ 明场显微镜