基础生物化学实验中科大实验二正交法研究影响酶活力因素.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *  六、主要参考资料  1、李建武 主编 .生物化学实验原理和方法 . 北京大学出版社 .1994 该书中的：p36-46 （离子交换层析法） 2、沈同 王镜岩主编 .生物化学 第二版 上册 高等教育出版社 .1993 该书中的：p 209、 210、215、216、220中有关论述 3、张树政 主编 .酶制剂工业 上册 .科学出版 社 .1998 * * 七、思考题 1） 指出有机溶剂分级沉淀法的原理及操作中 的注意事项。 2） 说明离子交换柱层析的原理及装好层析柱 的具体要求。 3） 比较线性梯度洗脱与阶段洗脱的区别。 4） 分别指出判断酶损失程度和酶提纯方法优 劣的标志。 * * 其 它 1） 这个实验较大，涉及到的理论知识和实验技术都较多，用的时间也很长，要求同学们一定做好预习，写好预习报告（方式不限，但一定要写在本子上，并留出记录实验数据和实验现象的位置），否则将严重影响实验进度！ 2） 你们年级的理论课还没讲到酶学部分，预习时可以看实验课教材（我在编写时已经进行了整理和补充）,但教材中有印刷错误,应以该课件为准. 3） 本实验从一开始，就要纵观全局，在各个环节都要注意防止酶失活；只要时间允许，一定要用测定酶活力的方法跟踪酶的去向； 4） 实验制品E3要保留！酶促反应动力学性质实验用。 * * 蔗糖酶米氏常数的测定 一、目的要求：了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习蔗糖酶米 氏常 数的测定方法。 二、实验原理：米氏常数Km等于酶反应速度达最大反应速度一半时的底 物浓度，单位是mol/L 。对于某一种特定的酶，在特定的反应条件 下，对应任何一种底物（如果它具有多个底物），它的米氏常数 Km是一个定值。在一个反应中，底物的浓度（S）是可以控制的，反 应的速度（V）可以测出，这样就可根据底物的浓度和反应的速度求 出该酶在本实验条件下的米氏常数。通常可以通过以下几种方法求 出Km值： 1）直接将数据代入米氏方程。 2）Lineweaver-Burk双倒数作图法（本实验采用该法），横轴的截距 为：-1/Km。 3）Hanes-Woolf作图法，横轴的截距为：-Km。 4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作图法，斜率为：-Km。 5）Eadie-Scatchard作图法，斜率为-1/Km。 * * 三、操作方法： 1.取试管8支，按0、1--7编号，0为空白。 2.按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃ 水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 3.取约20ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 4.于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml， 记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。 5.按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀 ，终止反应。 6.吸取反应混合物0.5ml，加入盛有1.5ml DNS试剂和1.5ml 去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释 定容至25ml，摇匀后，测定A540值。 * * 表1 Km值的测定 * * 四 数据处理： 以A值作为相对反应速度，以1/S为横坐标， 1/A为纵坐标作图，由图求出Km值。 五、思考题： 1.?说明米氏常数的物理意义及单位？ 2.?用双倒数法测定Km值时，应注意的主要问题是什么？ * * 用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响 一、目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用； 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。 二、实验原理 1. 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验使用正交实验设计法测定温度、pH值、和离子浓度三种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（≥3）的实验方法。 * * 正交法是通过正交表安排