湖北省枫杨种质资源的收集及遗传多样性分析.docVIP

华中农业大学 硕士学位论文 湖北省枫杨种质资源的收集及遗传多样性分析 姓名:黎曙光 申请学位级别:硕士 专业:园林植物与观赏园艺 指导教师:沈宝仙 3.2遗传多样性分析结果 3.2.1DNA的提取结果 提取植物基因组DNA一般以幼嫩的新鲜组织为材料,因为其细胞壁比较容易破解,而且与成熟的组织相比,从幼嫩的组织中提取的DNA含有多糖等杂质少。枫杨含多酚类物质多,容易褐化,在参考张虎平等(2003核桃基因标记的DNA提取方法的的基础上,本实验加大了PvP(从2%和增加到5%_和巯基乙醇的量(从2%增加到3%,结果褐化程度明显降低,磨样后的液体颜色从黑色变为绿色,静置lO 分钟后,颜色没有发现变化。 比较SDS和CTAB两种不同的方法提取了枫杨叶片中的基因组DNA,结果表明两种方法都能提取,但是CTAB提取的DNA检测带拖带少,效果更好(图3-1。 图3.1CTAB法和SDS法提取的DNA Fi￥一1DNA of CTAB and SDS extraetion 。(左边为CTAB法提取的DNA 3.2.2引物筛选的结果 以扩增的带型清晰无拖尾,条带数目在3条以上且有多态性为标准,从75条弓物中共筛选出的5条合适的引物用于所有样品的扩增,各引物的序列见表2。 表3-2ISSR引物 Table3-2ISSR Primers ISSRl ISSIt2 ISSIU 注:R=A/G, (AGsYC (AG8YT 队O8YA 、=c江. 1SSR4 ISSR5 19 (OA8RG (OAsRT 图2为引物筛选的图片,中间为Marker,1-11为初筛选出来的11条引物,两边是两个不同地方的DNA扩增图片,第2、4、8、9、10引物为复筛选出来的引物。 图2ISSR引物筛选 Fi92Selection oflSSR primers 3.2.3优化的反应体系和反应程序 经过实验比较,得出优化的PCR反应体系为:20llL的反应体系中,20ng/uL 的DNA模板1.0uL:10umoFuL的ISSR引物0.8uL:2mmol/L的dNTPsl uL:1U Taq酶;25mmoFL的M92+1.2uL:10X buffer2uL:双蒸水14.0uL。 优化的反应程序为:94℃预变性3rain,然后进行‘36个循环:94℃变性40s,55C 退火35s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸5rain。 3.2.4POR扩增的结果 经过统计,5条引物共检测到45条带,每个引物检测到的条带数介于5-13之间,平均每个引物检测到的条带数为9条;多态性条带43条,多态性百分率为95.6%,平均每个引物检测到的多态性条带数8.6条。 表3.3ISSR引物扩增结果 Thbk3-3Amplified results of珏;S日艮primers 引物扩增条带数目多态性条带数目多态性带谱百分比 primers Number of Number of Percentage of 丝型堡盟!!璺坐壁竖型!塑璺坐!!!型里坐坠唑ISSRl88100% ISSR25480% ISS ISSR47685.6% ISS Total454395.6% 图3-3引物ISSR3扩增的ISSR图谱 Fi93-3ISSR3amplification patterns by primer ISSRI (/A左至右From left to right:Marker ZXl ZX4-15,Marker 3.2.5六个主要县市的枫杨遗传多样性 对6个县市的样本,用筛选出的多态性强的5条引物和优化的反应程序作ISSR 扩增,得到多态性条带数5.13条不等,共计43条多态性带,遗传多样性分析表明,枫杨居群拥有较高水平的遗传多样性:物种水平遗传多样性相对较高,群体多态位点百分比(P达到95.6%,观测等位基因(Ao为1.9500,有效等位基因(AE为1.5392,Nei’s遗传多样性度(}IE为0.3254,Shannon’s多态信息指数(I为0.4943。 各参考指数武汉地区的多态百分率,观测等位基因最高。钟祥地区的有效等位基因、Nei’s基因多样性和信息指数最高。武汉地区的多态性百分率为91.11%,观测等位基因(Ao为1.9111。有效等位基因(AE为1.3330,Nei’s基因多样性为0.2264, Shannon’s信息指数为0.3681。钟祥地区的多态性百分率为88.89%,观测等位基因(AD 21 图3-5扦插成活图片 Fi93?5Photo ofCutting survival 图3-6扦插生根图片 Fi93-6Photo ofthe root ofCutting survival 3.3.2生根剂和切口