生物讲义第三章细胞融合.pptVIP

在HAT选择培养液中含有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，当DNA主要合成途径被氨基喋呤阻断时，具有HGPRT酶和TK酶的细胞便可通过应急途径利用HAT培养液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA。 未融合脾细胞 未融合骨髓瘤细胞 自身融合的脾细胞 自身融合的骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞(脾细胞/骨髓瘤细胞) 存活 存活 存活 死亡 死亡 脾细胞——HGPRT+和TK+ 用来制备杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞——HGPRT-和TK- 短命 融合后细胞混合液 HAT培养基 培养2周 正常培养基 HT培养基 培养1周 HAT培养基的筛选程序： 杂交瘤细胞 融合后的细胞混合液在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来 所筛选出的杂交瘤细胞并非均分泌针对于目的抗原的抗体，还需要把含有分泌抗体杂交瘤细胞的培养孔挑选出来，因此需要进行抗体检测。 3、抗体检测 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品 常用方法： 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法 要求 抗原 酶联免疫吸附法(ELISA) 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： 4、克隆化 在体外培养时分泌抗体的杂交瘤细胞的分裂速度要慢于不分泌抗体的杂交瘤细胞，经过多次传代培养后很容易丢失，故需要及时地把分泌抗体的杂交瘤细胞挑选出来单独培养。 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微挑拣法 80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells) ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的高度纯一的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb) 单克隆抗体优点： 高度纯一 高度专一 5、大规模培养——批量生产单克隆抗体的途径 常用的大规模培养方法： 动物接种法 转瓶培养法 反应器培养法 培养上清中X抗体的检测 克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养 获得大量单克隆抗体 动物免疫 细胞融合 混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 X抗原 B淋巴细胞 瘤的突变株 培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌 X抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/c 杂交瘤技术操作流程图解 应用： 疾病的诊断和治疗(生物导弹) 生物大分子的分类、鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离 产生T淋巴细胞杂交瘤生产均一的淋巴因子 研究生产其它细胞分泌产物 单克隆抗体-药物的结合物 T细胞性的淋巴瘤或胸腺瘤同T淋巴细胞的融合 第二节 ?杂交瘤技术与单克隆抗体 第三节 ?细胞融合和动物新品种培育 本章讲授提纲 第一节 ?细胞融合的技术方法 第三节 ?细胞融合和动物新品种培育 细胞融合技术是首先在动物细胞中实验成功的，此后在动物细胞中最成功的应用是单克隆抗体杂交瘤技术，而动物细胞杂交技术则还主要应用于核质关系等理论研究和克隆动物的制作中。 所谓动物细胞杂交，实际上也是以细胞融合为基础的，即利用人工的方法把分离的不同品种或不同种的动物细胞诱导成融合细胞，然后再经体外培养、分化、植回体内等操作生产杂种动物的过程。 获得杂种动物的大体技术路线 目标动物1 目标动物2 靶细胞 靶细胞 细胞融合 杂交细胞的筛选 体外培养 囊胚 植入养母体内 杂种筛选与鉴定 动物幼体 克隆牛的制做过程 细胞融合 去核 尽管动物细胞融合技术已经非常成熟，但由于动物细胞核融合过程中双亲的染色体不亲和性问题非常严重，两种动物细胞融合后出现染色体的排斥与丢失现象十分普遍，且丢失几乎是随机性的，因此要筛选出理想的杂种动物非常困难。 一般来说，两种动物的亲缘关系越远，其染色体排斥和丢失现象就越严重。 可见，要获得理想的杂种动物，仅仅依靠两种动物细胞的直接杂交是很困难的，这就需要在研究思路上加以开拓和创新。 目前，在获得理想杂种动物方面，主要创建了核移植与动物克隆等的技术和方法， 而且已经有了较多运用成功的例子，如克隆鱼、克隆蛙、克隆羊、克隆猪、克隆猴、克隆牛等。 克隆兔 克隆猫 克隆猴 克隆猪 创新应用例 多莉羊与寄母 克隆马 克隆骡子 体细胞克隆牛 本章内容到此结束 谢谢大家 * 谷氨酰胺(Gln) ，由次黄嘌呤和5一磷酸核糖焦磷酸在次黄嘌呤磷酸核糖转移酶的作用下，合成次黄