基因工程主要技术应用与其基本原理.ppt

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。 在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。 在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系。 只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在此阶段进行定量分析。 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为Ct值（threshold cycle） 模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小。 Ct值与模板起始拷贝数的对数值呈线性关系。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值 因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 PCR thermal cycler 5.5 DNＡ序列分析 Sanger链终止法或双脱氧法 链终止法是利用DNA（酶促）复制合成的原理。 需要指导DNA合成的模板、引物、4种5’-dNTP、DNA聚合酶以及所需的条件。 DNA 聚合酶只作用 3’-OH末端，在3’-OH聚合dNTP 新生单链的延伸方向只能是 5’ 3’ 方向 OH T C A T C A C OH 3’ ppp OH C + + ppi 5’PPP 5’PPP TCAACGATGG （鲨鱼齿梳） 手工测序结果 DNA自动测序 (a) 引物延伸反应 (b) 电泳和检测. (c) 结果输出 四色荧光染料标记的ddNTP (标记终止物法) 自动化测序 * 放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。 非放射性同位素： 荧光、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 * 利用毛细管虹吸原理，在高浓度NaCl/柠檬酸钠缓冲液的条件下，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜（或尼龙膜）向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在滤膜上。 * 电转移法其实相当于在凝胶与尼龙膜之间进行一次“电泳”，在凝胶上的的DNA片段带负电，在接通电源后，在尼龙膜的那端带正电，因为正负电荷吸引，带负电的DNA就会被吸引到尼龙膜上，并附着在上面。 而实验中的滤纸与毛细管转移作用的滤纸用途相同，把凝胶和海绵隔开，起到保护凝胶的作用，而海绵作用是固定凝胶的作用，因为两边的海绵被压缩后，对中间的凝胶会起到挤按作用，使凝胶固定在中间不会滑落。 * 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可抑制RNase酶活性） * * The Theory of the amplification kinetics is much different then what is actually observed. Picture explains the actual kinetics of the PCR process. Remember, PCR is an enzymatic process and is therefore affected by the same factors that effect ANY Enzymatic process. * Tth 聚合酶在Mn2+存在下以RNA为模板合成cDNA，因此可在高温下催化RT-PCR、反转录和引物延伸反应 Vent、Pfu、Pwo具有3-5外切酶活性 * * * * 3个过程组成PCR的一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长。 PCR原理 低温退火 高温变性 中温延伸 2n （二）平台期和平台效应 PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应（plateau effect）。 循环数 # 理论值 实际值 Log 产物DNA PCR过程的实时监测 影响因素： 引物、dNTP浓度降低 酶的活力下降 非特异性产物或引物二聚体与反应模板的竞争作用 二、PCR反应体系 1、缓冲液 Tris-HCl（pH8.3-9.0）缓冲液体系 Mg2+：Mg2+的浓度高低可显著影响PCR扩增产物的特异性 2.模板 单、双链DNA或cDNA