园艺-拟南芥侵染和筛选的流程.docVIP

1 摇菌 （1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB液体培养基，加入4ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天； 大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml菌液，过夜摇菌。 2 配侵染液 （1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂 Silwet L-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀； （2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步； （3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株； （4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。 3 农杆菌花序侵染 （1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株； （2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟； （3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住； （4）暗处理24小时后正常培养； （5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。 4 收种子 侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。 5 筛选T1代转基因阳性植株 5.1 选择性培养基筛选 （1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟； （2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤； （3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程； （4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug /ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜； （5）暗处理春化3d； （6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。 5.2 PCR检测T1代转基因阳性植株 每株拟南芥选取2片茁壮的叶片放入1.5ml离心管中； 在离心管中研磨叶片，注意样品不能在空气中融化，注意离心管的温度并及时放入液氮中速冻； （3）每支离心管中加入500ul改良CTAB溶液，震荡使其混合均匀，静置10分钟； （4）每支离心管中加入500ul氯仿，震荡，静置10分钟； （5）室温下12000rpm离心10分钟，取上清液至另一离心管中； （6）加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃沉淀至少30分钟； （7）室温下12000rpm离心10分钟，弃上清； （8）每支离心管中加入400ul 70%乙醇，震荡洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复两次，晾干后每个离心管中加入50ul超纯水待用； （9）1%琼脂糖凝胶电泳检测； DNA进行20ul体系PCR反应扩增目的基因； 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5.3 RT-PCR检测T1代转基因阳性植株