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藁本中主要有效成分阿魏酸在大鼠 体外及体内代谢研究 项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心 项目完成人：张金兰 摘 要 对藁本中主要活性成分阿魏酸在大鼠体外及体内的代谢进行了研究，研究结果表明阿魏酸在大鼠体外肝微粒体温孵体系中不代谢，也就是说阿魏酸不易发生氧化及还原型反应；建立了大鼠生物样品（尿、粪、胆汁及各种组织器官）前处理方法及HPLC-DAD分析方法，分析了给药后大鼠的尿、粪和胆汁，结果表明阿魏酸在大鼠体内的代谢转化率很低，主要以原药形式从尿中排出体外，粪中很少，胆汁中几乎没有；对尿样中代谢物进行了HPLC-MS分析，并对主要代谢物进行了制备及MS/MS分析，确定了大鼠尿中3个代谢物的结构，均为阿魏酸的葡萄糖醛酸型结合物。对阿魏酸在大鼠组织脏器中的分布研究表明，大鼠口服阿魏酸2小时后，主要分布于肝、肾、脾、肺；心脏中没有发现，另外胃中仍有大量阿魏酸存在。综合以上结果对阿魏酸在大鼠体内的代谢及排泄途径进行了推断。 一、研究背景 藁本为伞形科藁本属植物，2000年版《中国药典》收载了两种藁本，即中国藁本（Ligusticum sinensis Olive）和辽藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitagawa），根及根茎入药。中国藁本主产于陕西、湖南、湖北、甘肃等省；辽藁本主产于河北、辽宁、内蒙古等省。具有抑菌、散风寒、祛湿止痛的功效。 藁本中化学成分以内酯类、酚酸类化合物为主，藁本水煎液及中性油具有抑菌、抗炎、解热、镇痛等多种作用。“九五”期间，我们参加了科技部攻关项目“中药复方药物标准化（范例）研究--藁本子课题，对中国藁本和辽藁本的化学成分进行了深入研究，共分离得到14个化合物；根据藁本的功效主治，设计了抗炎、镇痛、镇静及抗血栓形成的药效学实验，并对藁本粗提物及单一成分进行了试验，结果表明，藁本粗提物具有明显的抗炎、镇痛、镇静作用，阿魏酸抗炎作用不明显，但镇痛、镇静作用明显而且对ADP诱导的大鼠体内血小板凝聚具有抑制作用。 根据藁本中分离出的主要成分及药效学实验结果，我们先后建立了藁本中3种有效成分（阿魏酸、藁本内酯、藁本酚）的HPLC分析方法，对20个不同产地藁本药材的分析结果表明，阿魏酸是能够代表藁本功效主治的主要活性成分，可以作为控制藁本药材质量的定量指标。以阿魏酸作为含量测定标准品，藁本内酯作为鉴别成分，我们所建立的藁本质量控制方法被2000年版《中国药典》采用。 为了进一步了解藁本药材在生物体内的生物转化过程，我们首先对其主要有效成分阿魏酸进行体外及体内生物转化研究，为进一步进行中药材的生物体内过程研究奠定基础。 阿魏酸在大鼠体外及体内代谢研究策略 以Wistar种雄性大鼠作为研究对象，采用苯巴比妥钠诱导大鼠肝微粒体温孵体外代谢模型结合体内代谢研究方法， 阐明阿魏酸在大鼠体内的代谢产物结构，阿魏酸在大鼠体内代谢、排泄途径及组织分布情况。具体实验设计如下： 以Wistar种雄性大鼠作为研究对象，体重200g左右。 以苯巴比妥钠诱导大鼠，制备大鼠肝微粒体。 对阿魏酸进行大鼠体外肝微粒体温孵体系中代谢研究，并对大鼠体外肝微粒体温孵体系进行优化。 在优化的大鼠体外肝微粒体温孵体系中进行大量阿魏酸的体外代谢，制备代谢物并进行结构鉴定。 进行阿魏酸大鼠体内代谢研究，给药方式：口服灌胃。给药剂量：200mg/kg体重。 药物溶解方式：阿魏酸以生理盐水溶解，1NaOH调pH至8.5，TWEEN-80助溶，浓度为50mg/ml，搅拌成澄清的溶液。 生物样品收集：大鼠(n=4)在给药前均禁食12小时，以含5%蔗糖的生理盐水维持，同时收集空白尿和粪。给药后收集0-12小时及12-24小时尿和粪。大鼠(n=3)禁食12小时后，做胆汁引流手术，观察3小时，同时收集空白胆汁，然后口服灌胃给药，收集0-12小时及12-24小时胆汁。大鼠（n=3）禁食12小时后，给药，1.5小时后，断头取血，同时取大鼠的心、肝、脾、肺、肾。 建立阿魏酸在大鼠体内代谢的生物样品前处理方法。 建立阿魏酸在大鼠体内代谢的生物样品的HPLC-DAD分析方法，初步确定主要代谢物。 通过主要代谢物的HPLC-MS及代谢物制备来进一步确定主要代谢物的结构。 研究阿魏酸在大鼠体内的分布情况。 推断阿魏酸在大鼠体内的代谢及排泄途径。 三、仪器设备及实验材料 仪器设备 Waters 2690 996 PDA HPLC仪；HPLC Agilent 1100, MS PE SCIEX QSTAR HPLC-MS联用仪；Heidolph Diax 900 匀浆机；北京医用离心机厂制造LD5-2A离心机；北京市长风仪器仪表公司电热恒温水浴箱。 动物 Wista种，♂，大鼠，体重200g左右。 药品及试剂 阿魏酸一部分由植化室陈若芸教授提