《第3章细胞的研究方法》-公开课件.pptVIP

一、细胞培养 活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，否则就要死亡。因此，要进行体外细胞培养，就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件，其中选择最佳培养基是最关键的因素。 1.动物细胞培养 培养的动物细胞 几个概念 原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞。 传代细胞：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。 细胞系：有少数细胞能传40-50代次，仍保持原来染色体的二倍性和接触抑制的行为。 永生细胞系：有少数细胞在传到50代以后发生了遗传突变，带有了癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制传下去的细胞。 植物细胞培养最明显的特点是： ①可进行组织培养，由外植体生长出植株； ②不易无限传代和建立细胞系。 2. 植物细胞培养 (1) 外植体培养，诱发产生愈伤组织：如果条件适宜，尚可培养出再生植株。 (2) 悬浮细胞培养：在愈伤组织 培养技术基础上发展起来的一 种培养技术。 植物细胞培养大体有如下几种技术: (3) 原生质体培养：体细胞杂交，转基因等 (4) 单倍体培养：通过花药或花粉培养获得单倍体植株。 二、显微操作技术 所谓显微操作技术(micromanipulation)就是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术。 现在显微操作装置的设计越来越精密，已经有可能对细胞核进行解剖和注入微量物质（如核酸分子片段）。 NT-88NE-N型显微操纵仪 (日本Nikon) 注射吸管 固定吸管 细胞显微解剖手术图解 三、细胞融合 真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)； 来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。 目前诱导细胞融合的方法有三种： 1. 病毒介导的细胞融合（如仙台病毒） 2. 化学介导的细胞融合（如PEG） 3. 电激介导的细胞融合 单克隆抗体技术 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。 于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 HAT筛选 骨髓瘤细胞 脾细胞 目的抗原免疫的小鼠 细胞融合 抗体检测 克隆化 大规模培养 HGPRT TK HGPRT- TK- HGPRT+ TK+ 抗体检测 骨髓瘤细胞系 抗体 克隆 单克隆抗体制备的杂交瘤技术 免疫学上的一场革命 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶 本章重点 1. 电镜与普通光学显微镜的成像原理有何异同？ 2. 生物大分子定位研究的方法有哪些？ 谢谢大家！！ * 样品中的不同成分对某种化学试剂有不同的亲和性，如锇酸染脂肪；铅盐染蛋白质；醋酸铀染核酸等。 电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，只能观察到黑白图象。它不能像光镜切片染色那样通过改变波长而获得彩色图象。 * * 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内(in vrvo)的功能活动是十分困难的。 显然，如果把活细胞拿到体外进行体外培养(in vitro)来观察和研究，则要方便的多。 细胞冰冻断裂后的电镜图像 电子枪发射出的电子束作为“探针”，在样品表面进行扫描，电子束激发样品表面放出次级电子，被电荷的探测器收集后，在荧光屏上相应位置显示出明、暗差别。 用来观察标本的表面形态结构。 (scanning electron microscope, SEM) 4. 扫描电镜技术 扫描式电子显微镜 耳听毛的扫描电镜图像 一、 超速离心技术 第二节 细胞组分的分析方法 为了研究细胞的各种结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。离心是研究细胞器和生物大分子的必要手段。 离心机结构与原理示意图 马达 冷冻 真空 沉降物 转子 装甲室 离心分离技术 ?差速离心 ?密度梯度离心 密度梯度离心与差速离心结合可达到更精细的分离。 差速离心 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的亚细胞组分和各种颗粒。 利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图 匀浆物 肝脏 上清夜 完整 细胞 完整 细胞 1000g 20min 核 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 微粒体 内质网 100000g 120min 105000g 20min 静置20min 10000g 20min 核糖体 密度梯度离心（区带离心法） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下