SYBRGreen实时定量PCR检测外源基因拷贝数.docVIP

浙江理工大学学报 , 第 27卷 , 第 1期 ,2010年 1月 Journal of Zhejiang Sci 2Tech U niversity Vol. 27, No. 1, J an. 2010 文章编号 :167323851(2010 0120125205 SYBR G reen 实时定量 PCR 检测外源基因拷贝数 庄 　 强 , 钱 　 程 , 刘 　 立 (浙江理工大学生命科学院 , 杭州 310018 　　 摘 　 要 :以 SY BR Green 为荧光染料 , 通过携带双基因 GFP 和 IL 224, 并以绝对 定量的方法检测 GFP 在稳定细胞株 Hela 2GFP 基因组中的整合拷贝数 , 基因组上的整合拷贝数 。 。 关键词 :实时荧光定量 PCR ; SY BR Green ; 中图分类号 :Q789　　　 文献标识码 :A 0　 引 　 言 , 它以快速 、 安全 、 成本低等优点渐渐取代了价格昂贵 、 费时费力的 Sout hern blot 法 [123]。 在实际应用中该方法主要体现 在两种方式上 :一种是利用已知外源基因拷贝数的基因组作为标准品 , 通过建立标准曲线来进行绝对定 量 [1], 用该方法测定时需满足两大前提条件 :① 标准品的制作 , 由于标准品通常是通过 So ut hern blot 法来确 立的 , 因此这一前提条件已经在很大程度上限制了该方法的广泛应用 ; ② 基因组 DNA 的准确定量 [425], 而通 过测定 DNA 的质量来确定基因组的总数总是增大了操作上的误差 。 另一种则是以基因组上已知拷贝数的 内源基因作为内参 , 通过相对定量法来确定外源基因的拷贝数 [628]。即建立内参基因的 ΔCt 法就能克服第 一种方式所存在的两大瓶颈限制 , 因此具有更广阔的应用空间 [4,9]。 其中以 TaqMan 探针建立的内参基因 ΔCt 法随着近几年的发展日渐成熟 , 已成功应用于玉米 、 水稻 、 油 菜等多种转基因植物 [223,7,10], 以及斑马鱼 、 小鼠等转基因动物 [8,11]的配型和转基因拷贝数的定量分析上 。但 因其只能应用于单次特异反应中且价格也比较昂贵 , 限制了该技术被广泛的使用 。 本研究将利用 S Y BR Green 荧光染料所具有的非特异性 , 可用于任何双链 DNA 且价格低廉的优势 , 首 创将 DNA 双链结合染料 SY BR Green 应用实时荧光定量 PCR 测定外源基因拷贝数的研究中 , 以期建立起 一种高效且廉价的检测外源基因拷贝数的通用方法来广泛应用于各种研究 。 1　 实 　 验 1. 1　 实验材料 所有限制性内切酶 、 DNA 分子量 Maker 均购自 Ta KaRa 公司 ; T4DNA 连接酶 、 DNA 琼脂糖凝胶回收 试剂盒购自 Promega 公司 , 所有引物均由上海赛百盛公司合成 。 Q IAamp DNA mini kit 购自 Qiagen 公司 , 高糖 DM EM 培养基购自 G ibco 公司 , 胎牛血清购自 Hyclone 公司 。 S Y BR Green Real 2time PCR Master Mix 购自 TO YOBO 公司 。 E. coli 菌株 D H5α, 细胞株 Hela 2GFP 为本实验室保存 。 收稿日期 :2008-11-11 基金项目 :“ 863” 项目 (2006AA02Z126 ;973计划 (2004CB518804 ; 浙江省科技厅重点项目 (2006C23006 作者简介 :庄 　 强 (1984- , 男 , 硕士研究生 , 主要从事肿瘤基因治疗研究 。 通讯作者 :钱 　 程 , 教授 , Email :liuli7001@. cn 1. 2　 实验方法 图 1　 参照质粒 p GFP 2IL24构建图谱 1. 2. 1　 参照质粒的构建 先以 Eco RI 、 N ot I 双切 p EGFP 2N1(clontech 公司 得 到 732bp 的 GFP 基因片段 , 连在 pcDNA3. 0(clontech 公 司 的 Eco RI 2N ot I 位点 , 质粒命名为 p GFP ; 再以 B gl II 、 M l u I 双切 p T 2IL24得到 630bp 的 IL 224基因片段 , 连在 p GFP 相应的 B gl II 2M l u I 位点上 , 得到参照质粒命名为 p GFP 2IL24(如图 1 。 1. 2. 2　 细胞培养与细胞基因组的提取 细胞株 Hela 2GFP 用含 10%FBS、 100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素的 DM EM 在 5%CO 2、 37℃ 培